目的基因的分離和克隆-預(yù)覽頁
【正文】 ————— = 106 In （ 1－ 103／ 3 109） ? 若用質(zhì)粒（ pBR322）克隆目的基因（ ）需要有 9 106克隆才能匯集人基因組全部 DNA序列 。 2. mRNA比基因組中基因少 , 因此篩選某一特定功能基因工作量較小。 （如圖） ? ⑵ 免疫結(jié)合法 ? 噬菌斑轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，各種 cDNA表達并呈現(xiàn)在噬菌體表面的蛋白質(zhì)便牢固地結(jié)合在膜上。 ㈢ 基因改造可獲得新型目的基因 采用基因拼接、基因缺失或點突變等方法，使表達產(chǎn)物量提高或降低毒性，有助于研究基因間的相互作用（如協(xié)同／抑制效應(yīng)）。 ? 二、根據(jù)目的基因本身特點選擇方法 ? 對從基因組中克隆的基因 (內(nèi)含子 ) 只能真核表達 ? 對從 cDNA中克隆的基因 (無內(nèi)含子 ) 可在原核 /真核表達 ? 要選擇 mRNA表達豐富的組織材料， PCR克隆的基因必須測序。 ② 粘－平 ? ㈡ 平端連接法 1. 同聚物加尾法 2. 用銜接物連接法 （ 帶有相應(yīng)酶切點的粘性末端 ） EcoRI粘性末端 ： 5’－ AGCGGCCGCG － 3’ TCGCCGGCGCTTAA－ 5’ BamHI／ PasI粘性末端： 5’－ GATCCGG…… .CACTGCA－ 3’ 3’－ GCC…… .GTG － 5’ BamHI PasI 4. T－ A克隆法 TaqDNA聚合酶在擴增目的基因 DNA的同時 , 能不依賴模板而在擴增產(chǎn)物兩 3’端加上兩個游離的“ A”。 二、聚合酶鏈反應(yīng) ：以 DNA變性復(fù)制的某些特性為原理，以目的DNA片段為模板 , 利用酶促反應(yīng)（ Taq酶），在特定引物的引導(dǎo)下，將加入的 4種 dNTP由引物沿模板從5’→3’ 按堿基配對原則 , 形成與模板 DNA互補的半保留復(fù)制鏈 , 新合成的鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。
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