【正文】 器、電泳儀、 PCR、 凝膠成像儀、常溫離心機(jī)等儀器的使用方法。 特此聲明。畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）中凡引用他人已經(jīng)發(fā)表或未發(fā)表的成果、數(shù)據(jù)、觀點(diǎn)等，均已明確注明 出處。 二、基本要 求 實(shí)驗(yàn)前需查閱關(guān)于 基因克隆及序列分析 的相關(guān)文獻(xiàn)，知道國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展、研究方法、數(shù)據(jù)處理以及結(jié)果分析等。 通過(guò)對(duì)藥材甲的 HSP 基因克隆及序列分析 得出相關(guān)的結(jié)論。 【 結(jié)果 】分別 獲得了 HSP70 和 HSP90 基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，分別命名為 SpHSP70 和 SpHSP90。通過(guò) ProtParam 軟件在線分析， SpHSP90 基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子式為 C3650H5816N968O1161S27，理論分子量為 kDa，等電點(diǎn)為 ，氨基酸序列中含有HSP90 家族的 5 個(gè)保守基序，以及細(xì)胞質(zhì)型 HSP90 C端基序（ MEEVD），結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明SpHSP90 具有 HSP90 家族的典型結(jié)構(gòu)特征，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析表明它與多種昆蟲的 HSP90序列有較高的同源性。 HSP90。 1982 年，在美國(guó)冷泉召開了第一屆研究熱激蛋白的國(guó)際會(huì)議，從此，世界上對(duì)于熱激蛋白的研 究便蓬勃發(fā)展起來(lái)，其分子伴侶的功能也逐漸被人發(fā)現(xiàn) [3]。如果使植物一直處于熱激狀態(tài)，熱激蛋白的合成往往只會(huì)持續(xù)幾個(gè)小時(shí)。由于熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)迅速，分布廣泛，即便在非熱激細(xì)胞中也存在著由熱激蛋白同源基因編碼的類似的蛋白質(zhì)。 Lindquist等人按其分子量大小將 HSPs分為大于80kDa（包括 HSP90、 HSP110）， 3070kDa（包括 HSP60、 HSP70、 HSP4 HSP32）和小于 30kDa（包括 HSP HSP28及泛素） 3大類。還有的分為 HSPl00（分子量范圍在 100104kDa）、 HSP90、 HSP70、 HSP60和小分子 HSPs（ sHSPs,分子量范圍在 1230kDa）等 5個(gè)家族。 熱脅迫、干旱脅迫及高鹽脅迫等環(huán)境因素脅迫均會(huì)影響諸多細(xì)胞蛋白質(zhì)的酶性質(zhì)或結(jié)構(gòu)組成 [5]，結(jié)果是變成非折疊或錯(cuò)誤折疊（ misfold）狀態(tài) （蛋白質(zhì)常常會(huì)形成沉淀或聚合在一起），從而喪失其催化結(jié)構(gòu)及活性。上游 ,存在如 nGAAn這樣的序列，稱為熱激調(diào)控元件（ Heat shock elements, HSE），又叫 熱應(yīng)答元件 ,它具有增強(qiáng)子的一些特性。如圖 。在適宜的溫度范圍之內(nèi)，昆蟲的生命活動(dòng)處于積極狀態(tài)，體內(nèi)能耗較小，死亡率較低，生殖力較強(qiáng)；而當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)一定范圍時(shí)，昆蟲的生命活動(dòng)就會(huì)受到嚴(yán)重影響，甚至?xí)鸢l(fā)育異常乃至死亡。熱激蛋白的表達(dá)可以提高生物體的耐熱性，這是科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)生物 體內(nèi)存在熱激蛋白基因后最早認(rèn)識(shí)到的，如果給生物以非致死性熱刺激，能夠增強(qiáng)生物對(duì)第 2次熱刺激的抵抗力，例如非洲蝗蟲（ Locusta migratoria）在 50℃ 熱激處理 2h后全部死亡，但在 39~45℃ 之間短暫預(yù)處理之后，由于熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)使其能在更高溫度下存活。通過(guò)對(duì)熱激蛋白基因缺失突變體的研究證明，至少某些熱激蛋白對(duì)有機(jī)體在高溫下的存活和耐熱性的獲得是必需的。 Solomon等 [10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞中導(dǎo)入 HSP70基因，其耐熱性的獲得比沒(méi)有導(dǎo)入 HSP70基因的細(xì)胞要快，當(dāng)在果蠅細(xì)胞中導(dǎo)入抑制熱激蛋白表達(dá)的基因時(shí)，其耐熱性的獲得要比沒(méi)有導(dǎo)入 HSP70基因的細(xì)胞慢。 Dahlgaard等研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理果蠅成蟲后，檢查不同時(shí)段 HSP70的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，果蠅的耐熱性與 HSP70的表達(dá)量呈正相關(guān)。 熱激蛋白在昆蟲體內(nèi)大量表達(dá)，是昆蟲生存的重要調(diào)節(jié)劑。成蟲白天喜鉆；蛀在日落 前后，遷出庫(kù)外在周圍環(huán)境介體 (如墻壁、門窗 )上活動(dòng)。幼蟲孵化后即鉆入食物內(nèi)進(jìn)行為害 ， 冬天幼蟲多在食物內(nèi)越冬 [17]。其中，熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)是目前研究得最多的，也是被認(rèn)為與昆蟲耐熱性關(guān)系最密切的因素之一 [19]。 5%、光照 14 h、以中藥材甘遂（ Euphorbia kansui）為食料培育。 使用SmartSpecTM 3000 核酸濃度分析儀分析所提取 RNA 的濃度及純度。經(jīng) EB 染色后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并將電泳結(jié)果拍照。C 孵育 10 min， 4176。 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 10 反轉(zhuǎn)錄合成第一條 cDNA 鏈 第一鏈 cDNA 主要用于基因中間片段的擴(kuò)增，按照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（ TaKaRa）的說(shuō)明書進(jìn)行合成。 –T Easy載體（ Promega）連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)色斑篩選，并進(jìn)行驗(yàn)證；將陽(yáng)性的克隆菌液送到 Invitrogen 公司測(cè)序。 NetNGlyc server 預(yù)測(cè) N糖基化位點(diǎn)，利用 ProtParam（ ） 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)， TMHMM 和 SignalP (:)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽和跨膜區(qū)域。 N端氨基酸為蛋氨酸（ Met， M）為穩(wěn)定型氨基酸，蛋白質(zhì)半衰期為 30 小時(shí)，不穩(wěn)定性指數(shù)未 ，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。通過(guò)對(duì)藥材甲 HSP70 基因的氨基酸序列與其他昆蟲 HSP70 氨基酸序列進(jìn)行多重對(duì)比分析，結(jié)果表明，它們均具有保守的結(jié)構(gòu)域，且具有較高的同源性 。 N端氨基酸為蛋氨酸（ Met， M）為穩(wěn)定型氨基酸，蛋白質(zhì)半衰期為 30 小時(shí)，不穩(wěn)定性指數(shù)未 ，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。 通過(guò)對(duì)藥材甲 HSP90 基因的氨基酸序列與其他昆蟲 HSP90氨基酸序列進(jìn)行多重對(duì)比分析，結(jié)果表明，它們均具有保守的結(jié)構(gòu)域，且具有較高的同源性。與赤擬谷盜 Tribolium castaneum()， 斜紋夜蛾 Spodoptera litura（ ）以及家蠶 Bombyx mori（ ）均在同一支上，這 與 Blast 同源性分析的結(jié)果大致上吻合 (圖 )。這與 Blast 同源性 分析的結(jié)果基本吻合 (圖 )。而熱激蛋白是一大類應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的重要的蛋白。這些都是 HSP70 家族的典型特征。系統(tǒng)發(fā)育樹的分析中， SpHSP90 與 赤擬谷盜Tribolium castaneum 的 TcHSP90 親緣關(guān)系最近，最先聚為一支。在 余昊，萬(wàn)方浩關(guān)于 B型煙粉虱和溫室白粉虱熱激蛋白 90基因 (HSP90)的研究中也得出了類似的結(jié)論 [7]。尤其要強(qiáng)烈感謝我的論文指導(dǎo)老師 — 楊文佳老師，他對(duì)我無(wú)私地指導(dǎo)和幫助，不厭其煩幫助我進(jìn)行論文的修改和改進(jìn)。 由于我的學(xué) 術(shù)水平有限，所寫的論文難免有不足之處，懇請(qǐng)各位老師批評(píng)和指正！ 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 18 參考文獻(xiàn) [1] 王建義 . 熱激蛋白的研究進(jìn)展 [J]. 山西林業(yè)科技 , 2021,（ 1） : 2628. 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