【文章內(nèi)容簡介】 組成部分。 HSP 基因的表達調(diào)控 在 HSP基因 539。上游 ,存在如 nGAAn這樣的序列，稱為熱激調(diào)控元件（ Heat shock elements, HSE），又叫 熱應答元件 ,它具有增強子的一些特性。當把這類 HSE接在其它基因 539。上游時 ,該基因即可獲得熱激蛋白的誘導性。細胞質(zhì)中存在熱激轉(zhuǎn)錄因子（ Heat shock transcription factors,HSFs），細胞在正常情況時 ,細胞內(nèi) HSP與 HSF結(jié)合，當脅迫發(fā)生時， HSP與變性蛋白結(jié)合 ,HSF從 HSP上分離 ,HSFs被磷酸化 ,然后進入細胞核，與 HSP基因的 HSE結(jié)合，這樣 HSP基因的轉(zhuǎn)錄就開始了，新合成的 HSP與 HSFs結(jié)合，阻止進一步合成 HSP。如圖 。因此 HSFs可能通過與 HSE的結(jié)合與分離來 控制啟動 HSP70基因的表達 [6]。 2. 熱激蛋白在昆蟲中的研究進展 昆蟲屬于變溫動物，調(diào)節(jié)和保持自身體溫的能力不強，而且環(huán)境的溫度直接決定了昆蟲體溫的高低變化，進而也決定了其生命過程的特點趨向和水平。因此，外界溫度是影響昆蟲生命活動的一項重要因素 [7]。在適宜的溫度范圍之內(nèi)，昆蟲的生命活動處于積極狀態(tài)，體內(nèi)能耗較小，死亡率較低，生殖力較強；而當環(huán)境溫度超過一定范圍時，昆蟲的生命活動就會受到嚴重影響，甚至會引起發(fā)育異常乃至死亡。對于不同種類的昆蟲來講，其耐熱性高低也不同，有些昆蟲能耐受很高的溫度脅迫，在高 于它正常生長溫度較多的條件下仍然可以正常存活，而有些昆蟲則是對溫度的變化十分敏感，極其微小的溫度浮動就可能會對其機體產(chǎn)生嚴重損傷。因此，昆蟲的熱脅迫耐受能力是決定了其種群能否在特定的外界環(huán)境下得以生存以及延續(xù)的一項很重要的條件。 貴陽學院畢業(yè)論文（設(shè)計） 5 圖 人和果蠅體內(nèi) HSPs 合成誘導機制示意圖（引自 Kiang and Tsokos,1998） 熱激蛋白的誘導表達能提高昆蟲的耐熱性 生物體對熱脅迫最基礎(chǔ)的反應就是熱激蛋白的表達。熱激蛋白的表達可以提高生物體的耐熱性，這是科學家們發(fā)現(xiàn)生物 體內(nèi)存在熱激蛋白基因后最早認識到的，如果給生物以非致死性熱刺激，能夠增強生物對第 2次熱刺激的抵抗力，例如非洲蝗蟲（ Locusta migratoria）在 50℃ 熱激處理 2h后全部死亡，但在 39~45℃ 之間短暫預處理之后，由于熱激蛋白的誘導表達使其能在更高溫度下存活。太陽照射下的果蠅幼蟲和蛹體內(nèi)大量表達熱激蛋白后，可以抵抗 40℃ 高溫 [8]。擬麻蠅（ Sarcophaga crassipalpis）非滯育蛹在 43℃ 條件下處理 2h，大量合成小分子 HSP23，使蛹的耐熱能力明顯提高，且隨著蛹進入滯育期，合成HSP的 mRNA表達增加，因此滯育蛹對環(huán)境溫度變化有很大耐力 [9]。精子發(fā)育對高溫極為敏感，但果蠅的初生精母細胞在導入 HSP70后對高溫遲鈍。通過對熱激蛋白基因缺失突變體的研究證明，至少某些熱激蛋白對有機體在高溫下的存活和耐熱性的獲得是必需的。例如，把多拷貝的 HSP70基因或 HSP70反義基因轉(zhuǎn)移到果蠅體內(nèi)的分子試驗證明， HSP70在果蠅耐熱性的獲得上具有重要作用 [1011]。這些研究結(jié)果均表明，熱激蛋白的誘導表達能夠提高昆蟲機體對高溫脅迫的耐受性。 熱激蛋白的表達能使昆蟲快速獲得耐熱性 熱激蛋白基因的存在 還與細胞獲得耐熱性的速度有關(guān)。 Solomon等 [10]研究發(fā)現(xiàn)，當在培養(yǎng)的果蠅細胞中導入 HSP70基因，其耐熱性的獲得比沒有導入 HSP70基因的細胞要快，當在果蠅細胞中導入抑制熱激蛋白表達的基因時，其耐熱性的獲得要比沒有導入 HSP70基因的細胞慢。攜帶 12種 HSP70原始基因的黑腹果蠅比無 HSP70基因的野生型獲得耐熱性的速度要快很多 [12]。人為加入 HSP70拷貝基因的黑腹果蠅的培養(yǎng)細胞獲得耐熱性的速度比無貴陽學院畢業(yè)論文（設(shè)計） 6 HSP70拷貝基因的普通細胞快，而攜帶 HSP70原始基因的培養(yǎng)細胞獲得耐熱性的速度更快[10]。 熱激蛋白的表達量與昆蟲耐熱能力正相關(guān) 熱激蛋白在生物體對熱脅迫的適應中，最引人注意的作用就是生物體在受到脅迫刺激后，對脅迫抗性的提高與熱激蛋白的表達上升普遍呈正相關(guān)關(guān)系。 Dahlgaard等研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理果蠅成蟲后，檢查不同時段 HSP70的表達水平發(fā)現(xiàn)，果蠅的耐熱性與 HSP70的表達量呈正相關(guān)。黃立華等 [13]以南美斑潛蠅（ Liriomyza huidobrensis）和美洲斑潛蠅（ Liriomyza sativae）為研究對象，發(fā)現(xiàn)溫和的溫度馴化使得 HSP70基因大量表達， 2種斑潛蠅的耐熱能力也 顯著提高，耐熱性誘導和消退的動力學與 HSP70的誘導和降解存在平行關(guān)系。崔旭紅等研究發(fā)現(xiàn)，在溫室條件下， B型煙粉虱（ Bemisia tabaci Bbiotype）體內(nèi) HSP70的表達水平隨著氣溫的變化而變化，在氣溫較高的 12時與 14時， B型煙粉虱成蟲體內(nèi) HSP70的表達量分別比 10時的表達量上升 。而在傍晚溫度下降、誘導壓力降低時， HSP70的表達量也隨之下降 [14]。 熱激蛋白在昆蟲體內(nèi)大量表達，是昆蟲生存的重要調(diào)節(jié)劑。 HSP 作為生物體在各種環(huán)境條件脅迫下誘導表達的蛋白質(zhì)，除抵御外 界不良逆境的作用之外，熱激蛋白與類固醇激素受體及蛋白激酶等信號傳導蛋白相互作用并且形成復合體，使其具有生物活性，即便是在無脅迫的條件下， HSP也是真核生物必不可少的 [15]。 3. 藥材甲研究概述 藥材甲 Stegobium paniceum (L.)是世界性分布的重要儲藏物害蟲，食性比較復雜，主要以煙草、動植物藥材、圖書檔案、文物等為食，甚至會取食鋁箔，錫箔等金屬制品 [16]。據(jù)室內(nèi)飼養(yǎng)和倉庫內(nèi)觀察，藥材甲老齡幼蟲在化蛹前建一個蟲室，新羽化成蟲往住在蟲室內(nèi)滯留 35天后方從食物中鉆出。成蟲白天喜鉆；蛀在日落 前后，遷出庫外在周圍環(huán)境介體 (如墻壁、門窗 )上活動。成蟲從食物中鉆出即開始交配，交配日節(jié)律與遷出活動節(jié)律相關(guān)，室內(nèi)觀察平均交配持續(xù)時間為 。成蟲羽化后第 3夭就開始產(chǎn)卵，但最初產(chǎn)的卵多為無性卵，不能正常發(fā)育，一般在羽化 45天后，也即成蟲開始交配后出現(xiàn)產(chǎn)卵高峰。每頭雌蟲可產(chǎn)卵數(shù)十粒，多數(shù)產(chǎn)在食物表面的褶溝內(nèi)，有時也可集產(chǎn)十多粒在食物表面。幼蟲孵化后即鉆入食物內(nèi)進行為害 ， 冬天幼蟲多在食物內(nèi)越冬 [17]。 雖然溴甲烷和磷化氫等是目前藥材甲等儲藏物害蟲防治較為有效和使用普遍的熏蒸劑，但是前者對臭氧層有破壞 作用，世界糧農(nóng)組織已決議逐步停止生產(chǎn)和使用，后者由于害蟲抗藥性的產(chǎn)生，其使用受到了局限，更重要的是化學防治對環(huán)境的污染和對施藥者及消費者健康的影響，使人們的擔心和憂慮與日俱增 [18]。 貴陽學院畢業(yè)論文（設(shè)計） 7 4. 本研究目的和意義 目前，在全球氣候變暖的大條件下，極端高溫天氣出現(xiàn)的頻率明顯增加，藥材甲等儲藏物昆蟲對于高溫脅迫的耐受性及其機理已成為近幾年來昆蟲學研究領(lǐng)域中備受重視的問題。研究表明，昆蟲的熱脅迫耐受程度除了與其遺傳基礎(chǔ)有關(guān)之外，不同的昆蟲還會采用不同的生化及生理策略來抵御高溫脅迫，比如有些昆蟲可以在不同的溫度條件下 改變其細胞膜脂飽和度，有些昆蟲通過合成滲透性脅迫保護物質(zhì)（如海藻糖和多元醇等） 來提高對高溫脅迫的抵抗能力，而有些昆蟲則能夠誘導表達熱激蛋白或補償性地表達某些關(guān)鍵酶的異型酶或同工酶等等。其中，熱激蛋白的誘導表達是目前研究得最多的，也是被認為與昆蟲耐熱性關(guān)系最密切的因素之一 [19]。 所以，本研究旨在通過對藥材甲熱激蛋白基因序列進行克隆，并分析其基因組和蛋白質(zhì)的特征，以探討熱激蛋白的功能 [20]以及藥材甲對環(huán)境適應的分子機理，為藥材甲對溫度的適應性機制研究提供依據(jù)。 貴陽學院畢業(yè)論文（設(shè)計） 8 第二章 藥材甲 HSP70 和 HSP90 基因的克隆及序列分析 1. 材料與方法 1. 1 供試蟲源 藥材甲成蟲于 2021 年采自貴陽市藥材公司，在人工氣候?qū)嶒炇?29 177。1 ℃ 、 RH 75% 177。 5%、光照 14 h、以中藥材甘遂（ Euphorbia kansui）為食料培育。實驗以羽化后 2～ 3 d 成蟲作為試蟲。 試劑與儀器 主要試劑： RQ1 RNaseFree DNase Promega TRIzol Reagent Invitrogen PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit Takara One Step PrimeScriptTM RTPCR Kit Takara Taq 酶及 PCR 相關(guān)試劑 Takara 克隆載體 pGEM○RT Eeasy Promega 化學感受態(tài)細胞 Tran5ɑChemically Competent Cell 北京全式金 T4 DNA Ligase 北京泰天和 DNA Mkarker DL2021 plus 北京全式金 Xgal Amersco IPTG Amersco DEPC Amersco 蛋白胨 Tryptone Oxoid 酵母提取物 Yeast estract Oxoid Agarose 西班牙進口分裝 主要儀器： 凈化工作臺 SWCJCO 蘇州凈化設(shè)備有限公司 高速冰凍離心機 Mikro22R Hettich 高壓滅菌器 SS325 TOMY 常溫離心機 5415D Eppendorf 純水系統(tǒng)和儲水罐 Elix5+30L Tank Millpore MDF382E 型超低溫保存箱 SANYO BioRad 梯度 PCR 儀（ 1000Series Thermal Cycling Planform） C1000TM 美國 BioRad 公司 貴陽學院畢業(yè)論文（設(shè)計） 9 凝膠成像儀 Universal HoodⅡ