【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 組成部分。 HSP 基因的表達(dá)調(diào)控 在 HSP基因 539。上游 ,存在如 nGAAn這樣的序列，稱為熱激調(diào)控元件（ Heat shock elements, HSE），又叫 熱應(yīng)答元件 ,它具有增強(qiáng)子的一些特性。當(dāng)把這類 HSE接在其它基因 539。上游時(shí) ,該基因即可獲得熱激蛋白的誘導(dǎo)性。細(xì)胞質(zhì)中存在熱激轉(zhuǎn)錄因子（ Heat shock transcription factors,HSFs），細(xì)胞在正常情況時(shí) ,細(xì)胞內(nèi) HSP與 HSF結(jié)合，當(dāng)脅迫發(fā)生時(shí)， HSP與變性蛋白結(jié)合 ,HSF從 HSP上分離 ,HSFs被磷酸化 ,然后進(jìn)入細(xì)胞核，與 HSP基因的 HSE結(jié)合，這樣 HSP基因的轉(zhuǎn)錄就開(kāi)始了，新合成的 HSP與 HSFs結(jié)合，阻止進(jìn)一步合成 HSP。如圖 。因此 HSFs可能通過(guò)與 HSE的結(jié)合與分離來(lái) 控制啟動(dòng) HSP70基因的表達(dá) [6]。 2. 熱激蛋白在昆蟲(chóng)中的研究進(jìn)展 昆蟲(chóng)屬于變溫動(dòng)物，調(diào)節(jié)和保持自身體溫的能力不強(qiáng)，而且環(huán)境的溫度直接決定了昆蟲(chóng)體溫的高低變化，進(jìn)而也決定了其生命過(guò)程的特點(diǎn)趨向和水平。因此，外界溫度是影響昆蟲(chóng)生命活動(dòng)的一項(xiàng)重要因素 [7]。在適宜的溫度范圍之內(nèi)，昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)處于積極狀態(tài)，體內(nèi)能耗較小，死亡率較低，生殖力較強(qiáng)；而當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)一定范圍時(shí)，昆蟲(chóng)的生命活動(dòng)就會(huì)受到嚴(yán)重影響，甚至?xí)鸢l(fā)育異常乃至死亡。對(duì)于不同種類的昆蟲(chóng)來(lái)講，其耐熱性高低也不同，有些昆蟲(chóng)能耐受很高的溫度脅迫，在高 于它正常生長(zhǎng)溫度較多的條件下仍然可以正常存活，而有些昆蟲(chóng)則是對(duì)溫度的變化十分敏感，極其微小的溫度浮動(dòng)就可能會(huì)對(duì)其機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷。因此，昆蟲(chóng)的熱脅迫耐受能力是決定了其種群能否在特定的外界環(huán)境下得以生存以及延續(xù)的一項(xiàng)很重要的條件。 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 5 圖 人和果蠅體內(nèi) HSPs 合成誘導(dǎo)機(jī)制示意圖（引自 Kiang and Tsokos,1998） 熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)能提高昆蟲(chóng)的耐熱性 生物體對(duì)熱脅迫最基礎(chǔ)的反應(yīng)就是熱激蛋白的表達(dá)。熱激蛋白的表達(dá)可以提高生物體的耐熱性，這是科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)生物 體內(nèi)存在熱激蛋白基因后最早認(rèn)識(shí)到的，如果給生物以非致死性熱刺激，能夠增強(qiáng)生物對(duì)第 2次熱刺激的抵抗力，例如非洲蝗蟲(chóng)（ Locusta migratoria）在 50℃ 熱激處理 2h后全部死亡，但在 39~45℃ 之間短暫預(yù)處理之后，由于熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)使其能在更高溫度下存活。太陽(yáng)照射下的果蠅幼蟲(chóng)和蛹體內(nèi)大量表達(dá)熱激蛋白后，可以抵抗 40℃ 高溫 [8]。擬麻蠅（ Sarcophaga crassipalpis）非滯育蛹在 43℃ 條件下處理 2h，大量合成小分子 HSP23，使蛹的耐熱能力明顯提高，且隨著蛹進(jìn)入滯育期，合成HSP的 mRNA表達(dá)增加，因此滯育蛹對(duì)環(huán)境溫度變化有很大耐力 [9]。精子發(fā)育對(duì)高溫極為敏感，但果蠅的初生精母細(xì)胞在導(dǎo)入 HSP70后對(duì)高溫遲鈍。通過(guò)對(duì)熱激蛋白基因缺失突變體的研究證明，至少某些熱激蛋白對(duì)有機(jī)體在高溫下的存活和耐熱性的獲得是必需的。例如，把多拷貝的 HSP70基因或 HSP70反義基因轉(zhuǎn)移到果蠅體內(nèi)的分子試驗(yàn)證明， HSP70在果蠅耐熱性的獲得上具有重要作用 [1011]。這些研究結(jié)果均表明，熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)能夠提高昆蟲(chóng)機(jī)體對(duì)高溫脅迫的耐受性。 熱激蛋白的表達(dá)能使昆蟲(chóng)快速獲得耐熱性 熱激蛋白基因的存在 還與細(xì)胞獲得耐熱性的速度有關(guān)。 Solomon等 [10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在培養(yǎng)的果蠅細(xì)胞中導(dǎo)入 HSP70基因，其耐熱性的獲得比沒(méi)有導(dǎo)入 HSP70基因的細(xì)胞要快，當(dāng)在果蠅細(xì)胞中導(dǎo)入抑制熱激蛋白表達(dá)的基因時(shí)，其耐熱性的獲得要比沒(méi)有導(dǎo)入 HSP70基因的細(xì)胞慢。攜帶 12種 HSP70原始基因的黑腹果蠅比無(wú) HSP70基因的野生型獲得耐熱性的速度要快很多 [12]。人為加入 HSP70拷貝基因的黑腹果蠅的培養(yǎng)細(xì)胞獲得耐熱性的速度比無(wú)貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 6 HSP70拷貝基因的普通細(xì)胞快，而攜帶 HSP70原始基因的培養(yǎng)細(xì)胞獲得耐熱性的速度更快[10]。 熱激蛋白的表達(dá)量與昆蟲(chóng)耐熱能力正相關(guān) 熱激蛋白在生物體對(duì)熱脅迫的適應(yīng)中，最引人注意的作用就是生物體在受到脅迫刺激后，對(duì)脅迫抗性的提高與熱激蛋白的表達(dá)上升普遍呈正相關(guān)關(guān)系。 Dahlgaard等研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理果蠅成蟲(chóng)后，檢查不同時(shí)段 HSP70的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，果蠅的耐熱性與 HSP70的表達(dá)量呈正相關(guān)。黃立華等 [13]以南美斑潛蠅（ Liriomyza huidobrensis）和美洲斑潛蠅（ Liriomyza sativae）為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)溫和的溫度馴化使得 HSP70基因大量表達(dá)， 2種斑潛蠅的耐熱能力也 顯著提高，耐熱性誘導(dǎo)和消退的動(dòng)力學(xué)與 HSP70的誘導(dǎo)和降解存在平行關(guān)系。崔旭紅等研究發(fā)現(xiàn)，在溫室條件下， B型煙粉虱（ Bemisia tabaci Bbiotype）體內(nèi) HSP70的表達(dá)水平隨著氣溫的變化而變化，在氣溫較高的 12時(shí)與 14時(shí)， B型煙粉虱成蟲(chóng)體內(nèi) HSP70的表達(dá)量分別比 10時(shí)的表達(dá)量上升 。而在傍晚溫度下降、誘導(dǎo)壓力降低時(shí)， HSP70的表達(dá)量也隨之下降 [14]。 熱激蛋白在昆蟲(chóng)體內(nèi)大量表達(dá)，是昆蟲(chóng)生存的重要調(diào)節(jié)劑。 HSP 作為生物體在各種環(huán)境條件脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)，除抵御外 界不良逆境的作用之外，熱激蛋白與類固醇激素受體及蛋白激酶等信號(hào)傳導(dǎo)蛋白相互作用并且形成復(fù)合體，使其具有生物活性，即便是在無(wú)脅迫的條件下， HSP也是真核生物必不可少的 [15]。 3. 藥材甲研究概述 藥材甲 Stegobium paniceum (L.)是世界性分布的重要儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)，食性比較復(fù)雜，主要以煙草、動(dòng)植物藥材、圖書(shū)檔案、文物等為食，甚至?xí)∈充X箔，錫箔等金屬制品 [16]。據(jù)室內(nèi)飼養(yǎng)和倉(cāng)庫(kù)內(nèi)觀察，藥材甲老齡幼蟲(chóng)在化蛹前建一個(gè)蟲(chóng)室，新羽化成蟲(chóng)往住在蟲(chóng)室內(nèi)滯留 35天后方從食物中鉆出。成蟲(chóng)白天喜鉆；蛀在日落 前后，遷出庫(kù)外在周圍環(huán)境介體 (如墻壁、門(mén)窗 )上活動(dòng)。成蟲(chóng)從食物中鉆出即開(kāi)始交配，交配日節(jié)律與遷出活動(dòng)節(jié)律相關(guān)，室內(nèi)觀察平均交配持續(xù)時(shí)間為 。成蟲(chóng)羽化后第 3夭就開(kāi)始產(chǎn)卵，但最初產(chǎn)的卵多為無(wú)性卵，不能正常發(fā)育，一般在羽化 45天后，也即成蟲(chóng)開(kāi)始交配后出現(xiàn)產(chǎn)卵高峰。每頭雌蟲(chóng)可產(chǎn)卵數(shù)十粒，多數(shù)產(chǎn)在食物表面的褶溝內(nèi)，有時(shí)也可集產(chǎn)十多粒在食物表面。幼蟲(chóng)孵化后即鉆入食物內(nèi)進(jìn)行為害 ， 冬天幼蟲(chóng)多在食物內(nèi)越冬 [17]。 雖然溴甲烷和磷化氫等是目前藥材甲等儲(chǔ)藏物害蟲(chóng)防治較為有效和使用普遍的熏蒸劑，但是前者對(duì)臭氧層有破壞 作用，世界糧農(nóng)組織已決議逐步停止生產(chǎn)和使用，后者由于害蟲(chóng)抗藥性的產(chǎn)生，其使用受到了局限，更重要的是化學(xué)防治對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)施藥者及消費(fèi)者健康的影響，使人們的擔(dān)心和憂慮與日俱增 [18]。 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 7 4. 本研究目的和意義 目前，在全球氣候變暖的大條件下，極端高溫天氣出現(xiàn)的頻率明顯增加，藥材甲等儲(chǔ)藏物昆蟲(chóng)對(duì)于高溫脅迫的耐受性及其機(jī)理已成為近幾年來(lái)昆蟲(chóng)學(xué)研究領(lǐng)域中備受重視的問(wèn)題。研究表明，昆蟲(chóng)的熱脅迫耐受程度除了與其遺傳基礎(chǔ)有關(guān)之外，不同的昆蟲(chóng)還會(huì)采用不同的生化及生理策略來(lái)抵御高溫脅迫，比如有些昆蟲(chóng)可以在不同的溫度條件下 改變其細(xì)胞膜脂飽和度，有些昆蟲(chóng)通過(guò)合成滲透性脅迫保護(hù)物質(zhì)（如海藻糖和多元醇等） 來(lái)提高對(duì)高溫脅迫的抵抗能力，而有些昆蟲(chóng)則能夠誘導(dǎo)表達(dá)熱激蛋白或補(bǔ)償性地表達(dá)某些關(guān)鍵酶的異型酶或同工酶等等。其中，熱激蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)是目前研究得最多的，也是被認(rèn)為與昆蟲(chóng)耐熱性關(guān)系最密切的因素之一 [19]。 所以，本研究旨在通過(guò)對(duì)藥材甲熱激蛋白基因序列進(jìn)行克隆，并分析其基因組和蛋白質(zhì)的特征，以探討熱激蛋白的功能 [20]以及藥材甲對(duì)環(huán)境適應(yīng)的分子機(jī)理，為藥材甲對(duì)溫度的適應(yīng)性機(jī)制研究提供依據(jù)。 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 8 第二章 藥材甲 HSP70 和 HSP90 基因的克隆及序列分析 1. 材料與方法 1. 1 供試蟲(chóng)源 藥材甲成蟲(chóng)于 2021 年采自貴陽(yáng)市藥材公司，在人工氣候?qū)嶒?yàn)室 29 177。1 ℃ 、 RH 75% 177。 5%、光照 14 h、以中藥材甘遂（ Euphorbia kansui）為食料培育。實(shí)驗(yàn)以羽化后 2～ 3 d 成蟲(chóng)作為試蟲(chóng)。 試劑與儀器 主要試劑： RQ1 RNaseFree DNase Promega TRIzol Reagent Invitrogen PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit Takara One Step PrimeScriptTM RTPCR Kit Takara Taq 酶及 PCR 相關(guān)試劑 Takara 克隆載體 pGEM○RT Eeasy Promega 化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞 Tran5ɑChemically Competent Cell 北京全式金 T4 DNA Ligase 北京泰天和 DNA Mkarker DL2021 plus 北京全式金 Xgal Amersco IPTG Amersco DEPC Amersco 蛋白胨 Tryptone Oxoid 酵母提取物 Yeast estract Oxoid Agarose 西班牙進(jìn)口分裝 主要儀器： 凈化工作臺(tái) SWCJCO 蘇州凈化設(shè)備有限公司 高速冰凍離心機(jī) Mikro22R Hettich 高壓滅菌器 SS325 TOMY 常溫離心機(jī) 5415D Eppendorf 純水系統(tǒng)和儲(chǔ)水罐 Elix5+30L Tank Millpore MDF382E 型超低溫保存箱 SANYO BioRad 梯度 PCR 儀（ 1000Series Thermal Cycling Planform） C1000TM 美國(guó) BioRad 公司 貴陽(yáng)學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 9 凝膠成像儀 Universal HoodⅡ