【文章內容簡介】 L 70％乙醇洗，13000rpm，離心 5min，棄上清，晾干，加 30μL超純水溶解 [13]。質粒經 EcoRⅠ酶切圖譜分析后，進行測序鑒定。 軟件 DNAStar；GENEDOC ；MatchCode ；Primer Premier ；Cluster W ；Rasmol Version 。2 結果與分析 基因保守片段的克隆與分析設計的引物 2 從毛竹 cDNA 中擴增出大小約 400bp 的 DNA 片段（圖 1 左） ，對其進行酶切分析得到（圖 1 右） 。 A BA B圖 1 RTPCR 產物和 EcoRⅠ酶切產物電泳檢測 Gel electrophoresis of RTPCR products and EcoR I digested products注：圖 1 A 中 1 和 2 泳道均是 RT－PCR 產物，B 中 4 個泳道均是 20μL EcoRⅠ酶切產物。 Marker 為 200bp DNA Ladder。從紅殼竹和角竹的 cDNA 中擴增出大小分別為616bp 和 613bp 的 DNA 片段（圖略） ，并經酶切驗證。得到基因 LhcaH01（GenBank EU513200）和LhcaJ01（GenBank EU513201 ） 5’和 3’端 RACE 擴增與分析 為獲得毛竹基因的全長，分別設計了 5’和3’引物，并利用 RACE 試劑盒所帶的通用引物 UPM和 NUP，配對進行擴增（圖 2 A B） ，分別得到大小約 600bp 的產物。對它們進行酶切分析驗證（圖 2 C D） ，與目的片段完全吻合。 cDNA 全長的克隆與序列分析通過對 5’和 3’端基因片段序列的拼接獲得了一個 cDNA 全長為 1051bp 的基因，對序列進行分析，結果顯示該基因序列從第 39bp 開始到第779bp 含有 1 個開放閱讀框（open reading frame, ORF）和一個中止密碼子，編碼 246 個氨基酸。在 5’端有 38bp 的非編碼區(qū) untranslated region, UTR） ，在 3’端含有 242bp 的非編碼區(qū)（ UTR）和Poly(A)30bp（圖 3） 。此基因定名為4LhcaPe01（GenBank EU035496） 。 A B C D圖 2 5’和 3’末端 RACEPCR 產物以及 EcoRⅠ酶切產物電泳 Gel electrophoresis of RACEPCR products and EcoRⅠ digested productsof 5’end and 3’ end 注：圖 2 中 A 兩個泳道均為 5’RACE PCR 產物，C 中泳道 1 為 5’RACE 酶切結果，D 中泳道 4 和 9 為 3’RACE 酶切結果。Marker 為 200bp DNA Ladder。圖 3 LhcaPe01 基因序列和開放閱讀框 Sequence and open reading frame of LhcaPe01 與禾本科其他物種的 Lhca1 基因比對通過blast軟件分析，在NCBI核酸數據庫中(有同源性的Lhc家族基因或光合系統中的類似基因共有115條，這些基因來自大麥(Hordeum vulgare)、水稻(Oryza sativa)、玉蜀黍(Zea mays)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)等十幾個不同的物種。Blast5～1134，其中毛竹（大麥)序列相似性最高，Score分值為 1134，一致性(identity)為93％，其次是玉米和水稻，都為91％。而在蛋白數據庫中，類似基因有103條，分值為129～458，與毛竹Lhca1同源性最高的也是大麥，得分458，然后是水稻，得分為435，再次是葡萄屬（Vitis vinifera） ，得分為374分（圖4） 。 圖4 毛竹LhcaPe01 基因編碼的氨基酸與禾本科其它屬物種的 Lhca1家族基因編碼的氨基酸序列多序列比較 Multiple sequence alignments of animo acids deduced by LhcaPe01 gene of P. edulis and Lhca1 genes of other plants in Gramineae familyThe accession number for Oryza rufipogon :CU406801。 Oryza sativa: NM0010640。 Zea mays:AY106149。 Zea mays: DQ244416, Horedeum vulgare : AF218305. 6圖5 毛竹LhcaPe01基因與其它植物的Lhca1系統樹分析 Phylogeic tree analysis of LhcaPe01 of P. edulis and Lhca1s from different plantsThe accession number for Oryza rufipogon: CU406801。 Oryza sativa: NM0010640。 Zea mays: AY106149。 Zea mays: DQ244416。 AK248263, Horedeum vulgare : AK250122, AF218305, S68728. 根據DNAStar MegAlign軟件，用Cluster W軟件做同源性比對，對禾本科內毛竹與不同屬間的Lhca1基因進行聚類分析，得到系統樹（圖5），從圖5中可以看出：毛竹Lhca1與水稻屬兩個種最為接近，其次是大麥屬四個種，最后是玉蜀黍2個種。 剛竹屬內不同物種間同源性比較用上述同樣的方法對剛竹屬內不同物種間同源性進行比較，得到如下的序列距離（表1）。剛竹屬三種竹種紅殼竹、毛竹和角竹保守區(qū)內核酸序列同源性非常高，紅殼竹與毛竹和角竹的同源％％，而毛竹和角竹的同源性％。推導的氨基酸序列同源性比對結果顯％，而毛竹和角竹的同源性高達100％（圖6）。表1 剛竹屬三竹種核酸序列距離 Sequence distances between three bamboos of Phyllostachys注：1為紅殼竹，2為毛竹，3為角竹。圖6 毛竹LhcaPe01基因編碼的氨基酸與同屬內其它竹種的Lhca1 家族基因編碼的氨基酸序列多序列比較 Alignment of the deduced animo acids sequences of P. edulis’s LhcaPe01 and Lhca1 sequences of other plants in