【文章內(nèi)容簡介】 果 啟動子區(qū)包含推測的 ABA 反應(yīng)元件 (ABRE)，位于起始密碼的736728 之間， ABRE 元件存在于不同物種對 ABA 應(yīng)答的基因中。由于 AtNHX1啟動子的活性可被 NaCl、 KCl 和 ABA 上調(diào) ,表明 AtNHX1 的表達受鹽和 ABA 的上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。 NaCl 對 AtNHX1 的上調(diào)程度在 abi11(ABA 不敏感突變體 )、 aba21 和 aba31(ABA 缺乏突變體 )中被減少，但在突變體 abi2 sos1(質(zhì)膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 SOS1 突變體 )、 sos2(蛋白激酶基因 SOS2 突變體 )和sos3(鈣結(jié)合蛋白基因 SOS3 突變體 )并無類似情況發(fā)生。 ABA 誘導的 AtNHX1 的表達同樣在 abi11 中被減少，但 abi21 中沒有。這些結(jié)果表明，鹽脅迫下在轉(zhuǎn)錄水平上 AtNHX1 表達的增強，部分地依賴于 ABA 的生物合成和 ABA 通過 ABI1發(fā)出的信號。 ABI1 可以調(diào) 控 NHX1 等基因的表達， ABI2 則可以通過抑制 SOS2的激酶活性或 SOS2 底物的活性來負調(diào)控離子均衡。 液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的功能研究 目前在這方面的研究主要從以下幾方面展開：一是 NHX1 基因表達可部分恢復(fù)酵母 nhx1 突變表型 ， Xia 等 【 14】 利用RTPCR 從甜菜 Beta vulgaris NHX1 同源的 BvNHX1 基因。將 Bvulgaris Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因 BvHNHX1 在對鹽敏感的酵母 nhx1 突變體ena14nhx1 菌株中異源表達，結(jié)果證實 BVNHX1 至少與酵母 NHX1 基因功能部分等價。 Hamada 等 【 15】 從鹽生植物 濱藜 中克隆出 Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白，命名 AgNHX1。 內(nèi)蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 同時將其在酵母 NHX1 突變體中表達結(jié)果對 NHX1 的功能有部分互補性。而Gaxiola 等 【 16】 將 AtNHX1 在對 NaCl敏感的酵母 nhx1 突變體菌株中進行異源表達，結(jié)果表明 AtNHX1 能抑制 nhx1 突變體的敏感表型， AtNHX1 的某些功能和酵母NHX1 是等價的， AtNHX1 恢復(fù)酵母 nhx1 突變體 Na+耐性的功能與酵母內(nèi)源的ScNHX1 功能相似。二是擬南芥植物過量表達 AtNHX1 基因，轉(zhuǎn)基因植株在200mmolNaCl的條件下生長發(fā)育良好。 Apse 等認為耐鹽性的提高與 ANHX1 的高水平轉(zhuǎn)錄，翻譯及 Na+/H+轉(zhuǎn)運體活性有關(guān) 【 17】 。 Junsheng Zhao 等 將 AtNHX1 轉(zhuǎn)到 tall fescue (Festuca arundinacea)中，過量表達 AtNHX1 基因可以顯著提高轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性， 200mM NaCl溶液中，顯出比對照組更強的耐性。在根細胞的液泡中積累了更多的 Na+，歸 因于 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運體活性的增強。他們認為 Na+/H+轉(zhuǎn)運體促進 Na+在根細胞的液泡中積累， 減少了鹽的毒害作用也就增強了植物耐鹽性 【 18】 。Xue 等 【 19】 在小麥中過量表達 AtNHX1，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥在鹽土壤中谷粒產(chǎn)量提高，并且谷粒大而重。在 100~150mM NaCl條件下，轉(zhuǎn)基因植株與對照組相比，葉中積聚的 Na+濃度較低， K+濃度較高。這些結(jié)果表明，提高液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄水平，能使小麥的耐鹽性及在鹽土壤中谷粒的產(chǎn)量提高。 Gaxiola 等 【 20】的實驗進一步證實耐鹽性是由于液泡轉(zhuǎn)運體的存在，他們將擬南芥液泡膜 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因 AtNHX1 及 H+PPase基因 AVP1 同 時過量表達獲得的轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果比單獨過量表達兩者之一的轉(zhuǎn)基因植株具有更強的耐高鹽的能力。這些結(jié)果顯示擬南芥液泡膜焦磷酸酶 (H+PPase)AVP1 的過量表達，明顯增加了轉(zhuǎn)基因植株跨液泡膜質(zhì)子梯度，促進了 AtNHX1 介導的活性，將 Na+更多的區(qū)隔化至液泡。為了較深入研究 NHX1 基因的作用，國內(nèi)外研究員做了很多的探討。 Sottosanto 等通過 TDNA 插入突變體 NHX1 植株和分析 atnhx1 缺失突變體 DNA 芯片，發(fā)現(xiàn) 在對照及 100mM NaCl鹽脅迫的土壤條件下，探討成熟植物缺失 AtNHX1 基因?qū)ζ渌D(zhuǎn) 錄本的影響，發(fā)現(xiàn) nhx1 均影響了轉(zhuǎn)錄本的表達，而在 100mM NaCl脅迫下基因的變化更大 ；其次，在離子動態(tài)平衡方面，細胞內(nèi)囊泡運輸，蛋白質(zhì)定位以及其它細胞過程中發(fā)揮作用 【 21】 。 Rajagopal等 【 9】 認為 PgNHX1 功能在整個生命周期都起作用， Na+大都積累在老葉中，種子中極少。 自 1976 年分別首次在動物老鼠腎細胞質(zhì)膜上和植物大麥質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn) Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。后發(fā)現(xiàn)的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白廣泛存在于細菌、酵母、藻類、動物和高等植物的膜系統(tǒng)上。 目前在GenBank 上登錄的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白 核酸序列達到 500 多個。包括人類 Na+/H+ 內(nèi)蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 轉(zhuǎn)運體 NHE1【 22】 、鹽生植物中間偃麥草 Elytrigia intermedia TiNHX1【 23】 、鹽地堿蓬S salsa SsNHX1【 24】 、甜土植物甜菜 BvNHX1【 14】 、經(jīng)濟作物小 麥 TaNHX1【 25】 、水稻OsNHX1【 26】 、刺槐 RpNHX1【 27】 等動植物的 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。 本研究的目的及意義 白 刺屬（ Nitraria L.）是蒺藜科 (Zygophyllaceae)的古老小屬，中國有 8 種，內(nèi)蒙古有 4 種 .該屬植物是我國內(nèi)蒙古、 甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群種之一，為耐干旱、耐鹽堿、抗風蝕沙埋、生長快、易繁殖的優(yōu)良防風固沙先鋒植物。白刺屬植物具有很高的開發(fā)利用價值，如營養(yǎng)保健價值、藥用價值、生態(tài)價值、經(jīng)濟價值等。而基于白刺特有的耐鹽堿抗旱能力，受到鹽、堿、旱的三重脅迫，其基因和蛋白水平的表現(xiàn)必定與目前研究的植物耐鹽機理存在較大差異。張建秋等研究發(fā)現(xiàn)，他們克隆到的白刺鹽堿脅迫相關(guān)基因片段與目前已知的植物耐鹽基因存在較大差異，這預(yù)示著白刺可能存在較特殊的耐鹽堿機理 【 28】 。他們通過雙向電泳分析白 刺鹽脅迫蛋白，發(fā)現(xiàn)某些特異性表達蛋白在 其他耐鹽植物的研究中沒有被 發(fā)現(xiàn)，部分證明了可能存在不同于其他植物耐鹽性的機理，因此對鹽堿均有較高的耐受性 【 29】 。因此從分子生物學角度探討耐鹽機理具有重要的理論意義，目前對白刺的研究主要是生態(tài)學方面的，對其耐鹽堿基因的報道非常少，還未發(fā)現(xiàn)白刺 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的相關(guān)報道。本研究中我選擇了生于輕度鹽漬化低地、湖盆邊緣、干河床邊，可作為優(yōu)勢種并形成群落的小果白刺。 肌動蛋白最初于 1949 年在動物骨骼肌細胞中發(fā)現(xiàn)并加以命名，我國科學家閆隆飛等在 1963 年首次提出高等植物存在肌動蛋白 【 30】 ，肌動蛋白廣泛 存在于高等植物的各種組織細胞中，如花粉、莖韌皮部、葉表皮細胞、葉鞘細胞、根毛、卷須等，它是構(gòu)成細胞骨架的主要結(jié)構(gòu)蛋白。植物肌動蛋白通常由 376377 個氨基酸組成，肌動蛋白利用其分子表面與很多肌動結(jié)合蛋白發(fā)生相互作用，植物肌動蛋白具有高度保守性。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足 :①不存在假基因，以避免基因組 DNA 的擴增。②穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織中，而且其表達量無顯著性差別等條件，高度或中度表達，但不是太高或低表達 。③穩(wěn)定表達于不同類型的細胞和組織中，而且其表達量是近似的，無顯著性差別 。④表達水平與細胞周期及細 胞是否活化無關(guān) 。⑤不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實驗處理措施的影響。 Actin 基因是管家基因之一，在各種不同器官上恒定表達，因而它可以用作分子內(nèi)標來研究其它基因的表達差異。現(xiàn)在還沒有白刺肌動蛋白基因的克 內(nèi)蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 隆報道，本文旨在克隆其肌動蛋白基因，分析基因序列確證該基因作為分子內(nèi)參的可能性，為研究白刺其他基因的表達奠定基礎(chǔ)。 2 材料與方法 材料 植物材料的培養(yǎng) 實驗所用材料為 小果 白刺 （ Nitraria sibirica Pall.），別名 西伯利亞白刺 【 31】 ， 實驗室快繁試管苗（陳貴林教授贈予 ），培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA mg/L+50mM NaCL, 溫度為 (25177。 1)℃ ,光照強度 36~40μ mol m2 s1,光照 時間 14 h d1【 32】 。 實驗試劑及配制 （ 1） 500mM EDTA 溶液 （提 RNA 用 DEPC 處理水配制） ， pH=. （ 2） 5M Nacl（提 RNA 用 DEPC 處理水配制） . （ 3） 10MLiCl， 4℃保存 . （ 4） 1MTrisHCl（ RNA 用 DEPC 處理水配制） ， pH=,冷卻后校正 pH 值 . （ 5） 10 MOPS RNA 電泳液 ， 700mLDEPC 處理的滅菌水溶解 MOPS，用 2M NaOH調(diào) pH 至 ， 加 20mLDEPC 處理的 1M 的乙酸鈉和 20mlDEPC 處理的 的 EDTA（ pH=）。 DEPC 水定容至 1L。（用 的濾膜過濾除菌，室溫避光保存） （ 6） 50Tris乙酸（ TAE）緩沖液 成分及終濃度 配制 1L 溶液各成分的用量 內(nèi)蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) 242g Tris ml 的冰乙酸（ mol/L） 200ml 的 mol/L EDTA（ pH ） 補足 1L （ 7） CTAB 提取 RNA 緩沖液為： 2% (w/v)g/ml CTAB 100 mmol/L TrisHCl (pH ) mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA (pH ) % β 巰基乙醇 (使用前加入 ) DEPC 處理水 定容到 500 ml （ 8） TE buffer（ 10mM Tris pH=、 1mM EDTA pH=） . （ 9）酚 /氯仿 /異戊醇 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCA 25： 24： 1) 25份水平衡酚， 24份氯仿， 1 份異戊醇混合，加入 8羥基喹啉 Hydroxyquinoline，使其終溶度為 %. （ 10） 氯仿 /異戊醇 chloroform/isoamyl alcohol (CA 24： 1) （ 11） 水平衡酚 制備 500g 苯酚加入 200ml 滅菌 DEPCH2O ，平衡，直至飽和， 加入 8羥基喹啉 Hydroxyquinoline，終溶度為 %. （ 12） 3M 醋酸銨（ pH ） . （ 13）氨芐青霉素 Ampicillin (100mg/ml )， m過濾膜過濾除菌 . （ 14） IPTG (24mg/ml) ， m過濾膜過濾除菌 . （ 15） XGal （ 20mg/ml） ， 加入 DMF(二甲基甲酰胺 )溶解，使其終濃度為 80%，20℃避光 保存。 （ 16） LB 培養(yǎng)基 （ 1%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， 1%NaCl， pH ） （ 17） LB/AMP 培養(yǎng)基 （ 1%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， 1%NaCl， Ampicillin （ 18） SOB 培養(yǎng)基 （ 2%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， %NaCl， KCl， 10mM MgCl） 內(nèi)蒙古 大學本科畢業(yè) 論文 (設(shè)計 ) （ 19） SOC 培養(yǎng)基 （ 2%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， %NaCl， KCl， 10mM MgCl， 20ｍ M 葡萄糖 （ 20） TB 溶液 Transformation Buffer HEPES 10mM， 15mM， KCl 250mM，加入蒸餾水 950ml， 用 5M KOH 調(diào) PH至 ，低 PH 不溶 ， 在加終濃度 為 55mM 的 ， 定溶到 1L, 過濾滅菌 , 4 度保存 。 實驗使用試劑盒 （ 1） TaKaRa RNA PCRKit（ AMV） （ 2） AXxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒 實驗用引物 實驗用 引物由 invitrogen 公司合成 DegNHXF： 5’ CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG 3’ PPIIFNAG DegNHXR： 5’ RTAIGCCATIARCATCAT 3’ MMLMAY Deg Act1： 5’ ATGGTIAARGCIGGITTYGC3’ MVKAGFA Deg Act2： 5’ CCACATYTGYTGRAAIGTIS3’ STFMW 3’RACE 特異性引物 NHXGSPF（ 1） ： 5’ATTTTGCCAGGCACTCAA3’ NHXGSP