報告基因和熒光淬滅(編輯修改稿)
2025-09-11 21:58 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 多，檢測器所接收到的熒光就越少。 如 Tsien amp。 Miyawaki采用 FRET技術(shù)檢測細胞內(nèi) Ca2+的濃度變化。他們將 CFP和 YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達于同一個細胞內(nèi)。當細胞內(nèi)具有高的 Ca2+濃度時， 鈣調(diào)蛋白 和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā) FRET，使受體蛋白 YFP發(fā)出黃色熒光，因此細胞呈黃色。當細胞內(nèi) Ca2+濃度低時， FRET幾乎不發(fā)生，因此檢測時 CFP被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細胞呈綠色。 FRET 敏排放 雙通道成像使用一種算法，糾正串擾激發(fā)和發(fā)射 受體漂白 也被稱為 施主去猝滅 受體光漂白時，這種技術(shù)措施增加了供體發(fā)射 熒光壽命成像顯微鏡（ FLIM） 熒光蛋白（或其他熒光）體壽命測量的變化 光譜成像 令人興奮的一個或兩個波長，測量供體和受體的完整光譜剖面 熒光偏振成像 測量偏振平行和垂直于激發(fā)高信號噪聲 FRET技術(shù)在細胞生物學應用 每個 FRET以上列出的方法都有長處和短處。 例如，一方面，兩個通道成像法是最簡單，但需要最復雜的控件集。 另一方面， FLIM的可以得到明確的測量 FRET效率，但是昂貴。 優(yōu)缺點 Principle of the assay Ryoichi Arai et al. Protein Eng. 2022。13:369376 熒光蛋白對選擇 熒光素酶 ， Luciferase 是指生物體內(nèi)能催化熒光素 或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱 按來源分類： 螢火蟲熒光素酶 （ FL） 6064 kD 細菌熒光素酶 （ BL） 7779 kD 按性質(zhì)分類： FL 蛋白質(zhì)和脂類復合物 BL ?、 ?兩個多肽亞基組成的單加氧酶 熒光素酶報告基因方法 發(fā)光機理： BL 以脂肪醛（ RCHO）為底物，在還原型黃素單核苷酸（ FMNH2）及氧 脂肪醛氧化成脂肪酸 +光子（ 490n熒光 ） FL 在 Mg 2+、 ATP、 O2 參與下，催化 D熒光素（ DLuciferin), 產(chǎn)生激活態(tài)熒光素 +光子（ 550580nM)熒光 檢測方法：熒光素酶檢測（ luminometer) 螢火蟲 (Photinus pyralis)螢光素酶和海腎 (Renilla reniformis)螢光素酶可在單個樣品中連續(xù)測量。測量過程是：加入螢光素酶檢測試劑 II (LARII)產(chǎn)生螢火蟲螢光信號，信號持續(xù)至少 1 分鐘，這樣先測量螢火蟲螢光素酶報告基因。定量螢火蟲螢光強度之后，再在同一樣品中加入 Stop amp。 Glo17
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