報告基因和熒光淬滅(編輯修改稿)
2025-09-11 21:58 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 多，檢測器所接收到的熒光就越少。 如 Tsien amp。 Miyawaki采用 FRET技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi) Ca2+的濃度變化。他們將 CFP和 YFP分別于鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽融合表達(dá)于同一個細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)具有高的 Ca2+濃度時， 鈣調(diào)蛋白 和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽結(jié)合，可誘發(fā) FRET，使受體蛋白 YFP發(fā)出黃色熒光，因此細(xì)胞呈黃色。當(dāng)細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度低時， FRET幾乎不發(fā)生，因此檢測時 CFP被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞呈綠色。 FRET 敏排放 雙通道成像使用一種算法，糾正串?dāng)_激發(fā)和發(fā)射 受體漂白 也被稱為 施主去猝滅 受體光漂白時，這種技術(shù)措施增加了供體發(fā)射 熒光壽命成像顯微鏡（ FLIM） 熒光蛋白（或其他熒光）體壽命測量的變化 光譜成像 令人興奮的一個或兩個波長，測量供體和受體的完整光譜剖面 熒光偏振成像 測量偏振平行和垂直于激發(fā)高信號噪聲 FRET技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用 每個 FRET以上列出的方法都有長處和短處。 例如，一方面，兩個通道成像法是最簡單，但需要最復(fù)雜的控件集。 另一方面， FLIM的可以得到明確的測量 FRET效率，但是昂貴。 優(yōu)缺點 Principle of the assay Ryoichi Arai et al. Protein Eng. 2022。13:369376 熒光蛋白對選擇 熒光素酶 ， Luciferase 是指生物體內(nèi)能催化熒光素 或脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱 按來源分類： 螢火蟲熒光素酶 （ FL） 6064 kD 細(xì)菌熒光素酶 （ BL） 7779 kD 按性質(zhì)分類： FL 蛋白質(zhì)和脂類復(fù)合物 BL ?、 ?兩個多肽亞基組成的單加氧酶 熒光素酶報告基因方法 發(fā)光機(jī)理： BL 以脂肪醛（ RCHO）為底物，在還原型黃素單核苷酸（ FMNH2）及氧 脂肪醛氧化成脂肪酸 +光子（ 490n熒光 ） FL 在 Mg 2+、 ATP、 O2 參與下，催化 D熒光素（ DLuciferin), 產(chǎn)生激活態(tài)熒光素 +光子（ 550580nM)熒光 檢測方法：熒光素酶檢測（ luminometer) 螢火蟲 (Photinus pyralis)螢光素酶和海腎 (Renilla reniformis)螢光素酶可在單個樣品中連續(xù)測量。測量過程是：加入螢光素酶檢測試劑 II (LARII)產(chǎn)生螢火蟲螢光信號，信號持續(xù)至少 1 分鐘，這樣先測量螢火蟲螢光素酶報告基因。定量螢火蟲螢光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入 Stop amp。 Glo17
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