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正文內(nèi)容

真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核(編輯修改稿)

2024-08-16 04:11 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 )表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。 分離功能的啟動(dòng)子: 將大腸桿菌基因組的酶切片斷,克隆在 pOK1質(zhì)粒載體的 MCS區(qū)的單克隆位點(diǎn)上; 將體外連接的 DNA重組分子,轉(zhuǎn)化給具 GalE+ 、 GalK - 的大腸桿菌寄主細(xì)胞,避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾; 將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基 (含有 PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫,檢測(cè)碳水化合物) 上,篩選轉(zhuǎn)化子(重組子產(chǎn)生紅色的菌落)。 pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動(dòng)子的因素 1. 選用的報(bào)告基因 galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶,是一種易于快速定量檢測(cè)的蛋白質(zhì)(鑒定啟動(dòng)子表達(dá)活性的強(qiáng)弱); 2. 應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性,篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子(分離功能啟動(dòng)子)。 菌寄主菌株( GalE+ GalT+ GalK- )作轉(zhuǎn)化受體; 常用的大腸桿菌表達(dá)載體 1. Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體 2. Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體 3. PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體 理論上,凡是 具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的 lac操縱子 的質(zhì)粒,都基本上具備了用作克隆基因表達(dá)載體的條件。這類表達(dá)載體的最突出的特點(diǎn)是,含有一條足夠大的編碼 β 半乳糖苷酶的 lacZ基因片斷。因此,每當(dāng)有一個(gè)克隆的外源DNA片斷插入到這個(gè)啟動(dòng)子之后,人保持著 lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時(shí),這個(gè)重組質(zhì)粒就會(huì)合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和 β 半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。 1. 經(jīng)過 Hae? 切割的 203bp的酶切片斷上具有 Lac操縱子的控制區(qū),包括阻遏物作用區(qū)、 CAP作用區(qū)以及 RNA聚合酶作用區(qū)、 β 半乳糖苷酶的頭 8個(gè)密碼子。 有一些對(duì)阻遏物作用不敏感的啟動(dòng)子,也被用來制備表達(dá)載體 2. 95bp的 Alu片斷: 不完整的 CAP結(jié)合序列 3. L8突變的 203bp區(qū)段,在 CAP結(jié)合序列里發(fā)生了 GA的轉(zhuǎn)換 4. 在 uv5突變,使 lac啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。( RNA聚合酶結(jié)合區(qū) TA顛換 ,相鄰堿基 GA的轉(zhuǎn)換) 質(zhì)粒的構(gòu)建: 將含有 lac啟動(dòng)子的 Hae? 酶切片斷,經(jīng)平末端連接,克隆到經(jīng) EcoR1切割并對(duì)其粘性末端進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)的 pBR322質(zhì)粒上。 增加 2個(gè)堿基對(duì) Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體 這種表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是,它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于 lac啟動(dòng)子表達(dá)載體系統(tǒng),并且是誘導(dǎo)型的。 構(gòu)建: 1. 大腸桿菌染色體 DNA的 Hind? 片斷, 含有 trp啟動(dòng)子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的部分序列。 2. 將此片斷,克隆到 pBR322質(zhì)粒的 Hind? 位點(diǎn),構(gòu)建成了 ptrpED3表達(dá)載體(含有兩個(gè) Hind? 位點(diǎn))。 3. Hind?部分酶切消化,將靠近 EcoR1位點(diǎn)的一個(gè) Hind? 位點(diǎn),經(jīng)核酸外切酶 ? 和 S1核酸酶處理,消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED51. 使用 Hind? 接頭,將 ptrpED51質(zhì)粒的 Hinf1片斷克隆到了 pBR322質(zhì)粒的Hind? 位點(diǎn)上,形成重組質(zhì)粒 pWT111 (含有 trp調(diào)節(jié)序列和 trpE基因的頭 7個(gè)密碼子)。 ? Trp啟動(dòng)子表達(dá)載體已用來生產(chǎn)了 α 干擾素和 γ 干擾素 ? 三啟動(dòng)子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動(dòng)子單元 PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體 是一種最廣泛使用大腸桿菌表達(dá)載體的啟動(dòng)子之一。 λ 噬菌體的阻遏物-操作系統(tǒng) cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。 42度時(shí),阻遏蛋白失活; 2830度時(shí), PL啟動(dòng)子完全被阻遏蛋白抑制。 通過改變溫度來控制 PL啟動(dòng)子的開閉 pPLc24表達(dá)載體: 用來表達(dá)天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。 這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體含有 MS2
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