真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系大腸桿菌的表達(dá)載體克隆的真核(編輯修改稿)
2024-08-16 04:11 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ）表達(dá)的半乳糖激酶的產(chǎn)量。 分離功能的啟動(dòng)子： 將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在 pOK1質(zhì)粒載體的 MCS區(qū)的單克隆位點(diǎn)上； 將體外連接的 DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給具 GalE＋ 、 GalK － 的大腸桿菌寄主細(xì)胞，避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾； 將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基 （含有 PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測(cè)碳水化合物） 上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。 pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動(dòng)子的因素 1. 選用的報(bào)告基因 galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測(cè)的蛋白質(zhì)（鑒定啟動(dòng)子表達(dá)活性的強(qiáng)弱）； 2. 應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動(dòng)子）。 菌寄主菌株（ GalE+ GalT+ GalK－ ）作轉(zhuǎn)化受體； 常用的大腸桿菌表達(dá)載體 1. Lac啟動(dòng)子的表達(dá)載體 2. Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體 3. PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體 理論上，凡是 具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的 lac操縱子 的質(zhì)粒，都基本上具備了用作克隆基因表達(dá)載體的條件。這類表達(dá)載體的最突出的特點(diǎn)是，含有一條足夠大的編碼 β 半乳糖苷酶的 lacZ基因片斷。因此，每當(dāng)有一個(gè)克隆的外源DNA片斷插入到這個(gè)啟動(dòng)子之后，人保持著 lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時(shí)，這個(gè)重組質(zhì)粒就會(huì)合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和 β 半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。 1. 經(jīng)過 Hae? 切割的 203bp的酶切片斷上具有 Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、 CAP作用區(qū)以及 RNA聚合酶作用區(qū)、 β 半乳糖苷酶的頭 8個(gè)密碼子。 有一些對(duì)阻遏物作用不敏感的啟動(dòng)子，也被用來制備表達(dá)載體 2. 95bp的 Alu片斷： 不完整的 CAP結(jié)合序列 3. L8突變的 203bp區(qū)段，在 CAP結(jié)合序列里發(fā)生了 GA的轉(zhuǎn)換 4. 在 uv5突變，使 lac啟動(dòng)子開始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。（ RNA聚合酶結(jié)合區(qū) TA顛換 ,相鄰堿基 GA的轉(zhuǎn)換） 質(zhì)粒的構(gòu)建： 將含有 lac啟動(dòng)子的 Hae? 酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng) EcoR1切割并對(duì)其粘性末端進(jìn)行填補(bǔ)修復(fù)的 pBR322質(zhì)粒上。 增加 2個(gè)堿基對(duì) Trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體 這種表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于 lac啟動(dòng)子表達(dá)載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。 構(gòu)建： 1. 大腸桿菌染色體 DNA的 Hind? 片斷， 含有 trp啟動(dòng)子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、 trpE基因、 trpD基因的部分序列。 2. 將此片斷，克隆到 pBR322質(zhì)粒的 Hind? 位點(diǎn)，構(gòu)建成了 ptrpED3表達(dá)載體（含有兩個(gè) Hind? 位點(diǎn)）。 3. Hind?部分酶切消化，將靠近 EcoR1位點(diǎn)的一個(gè) Hind? 位點(diǎn)，經(jīng)核酸外切酶 ? 和 S1核酸酶處理，消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED51. 使用 Hind? 接頭，將 ptrpED51質(zhì)粒的 Hinf1片斷克隆到了 pBR322質(zhì)粒的Hind? 位點(diǎn)上，形成重組質(zhì)粒 pWT111 （含有 trp調(diào)節(jié)序列和 trpE基因的頭 7個(gè)密碼子）。 ? Trp啟動(dòng)子表達(dá)載體已用來生產(chǎn)了 α 干擾素和 γ 干擾素 ? 三啟動(dòng)子串聯(lián)單元表達(dá)效率高于單啟動(dòng)子單元 PL啟動(dòng)子的表達(dá)載體 是一種最廣泛使用大腸桿菌表達(dá)載體的啟動(dòng)子之一。 λ 噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng) cI基因存在一個(gè)溫度敏感突變等位基因。 42度時(shí)，阻遏蛋白失活； 2830度時(shí)， PL啟動(dòng)子完全被阻遏蛋白抑制。 通過改變溫度來控制 PL啟動(dòng)子的開閉 pPLc24表達(dá)載體： 用來表達(dá)天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。 這個(gè)質(zhì)粒表達(dá)載體含有 MS2
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