山羊igfbp-6基因的克隆及其組織表達(dá)的發(fā)育性變化-游杰(編輯修改稿)
2024-08-31 15:57 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 0181。l去離子水進(jìn)行稀釋后作為第一管。接著從第一管中取稀釋液50181。l，加入450181。l去離子水進(jìn)行稀釋后作為第二管。如此反復(fù)，進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋。各梯度稀釋液作為標(biāo)準(zhǔn)品備用。取101～1010的標(biāo)準(zhǔn)品各1181。l加入到相應(yīng)的反應(yīng)體系中，在同樣的反應(yīng)條件下(除退火溫度不同外)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光定量PCR儀繪制的PCR動力學(xué)曲線，以樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，分別繪制IGFBP6和βactin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將模板cDNA解凍。反應(yīng)體系如表3。體系配好后徹底混勻，上機(jī)，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算未知樣品的起始拷貝數(shù)。反應(yīng)體系在伯樂iq5熒光定量PCR儀上進(jìn)行。檢測中為每個待測樣品cDNA設(shè)置3個重復(fù)，對得到的3個Ct值取平均值，以備帶入公式進(jìn)行計(jì)算。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30s。然后95℃變性5s，℃退火30s，72℃延伸15s，共40個循環(huán)。熔解曲線分析：95℃ 1min，55℃ 1min。然后從55℃開始，℃，時間為10s，81個循環(huán)，整個過程收集熒光。根據(jù)樣品熒光曲線和內(nèi)參熒光曲線的Ct值計(jì)算定量結(jié)果。表4 PCR反應(yīng)體系Table 4 PCR Reaction system組成成分RealMasterMix/20SYBR solution正向引物(10uM)反向引物(10uM)cDNA模板1181。lRNasefree H2O 統(tǒng)計(jì)分析采用相對定量解析方法，選用βactin作為看家基因，對擴(kuò)增效率達(dá)到要求的樣品，根據(jù)定量儀器自帶分析軟件計(jì)算各基因各時間點(diǎn)的拷貝數(shù)，以目的基因mRNA的拷貝數(shù)（單個部位的不同時間點(diǎn)/單個時間點(diǎn)不同部位的樣品的最大拷貝數(shù)設(shè)為1）與對應(yīng)樣品內(nèi)參基因mRNA的拷貝數(shù)（單個組織的不同時間點(diǎn)/單個時間點(diǎn)不同組織最大拷貝數(shù)設(shè)為1）的比值表示基因mRNA的相對表達(dá)量。 GLM程序進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果以最小二乘均數(shù)177。標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Duncan法進(jìn)行均數(shù)間的多重比較。3 試驗(yàn)結(jié)果與分析 熒光定量分析 Realtime PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立根據(jù)回收的標(biāo)準(zhǔn)品DNA，按照1103~1109 的范圍梯度內(nèi)進(jìn)行IGFBP6基因及看家基因的定量反應(yīng)。得到2條Realtime PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。%~%之間，~，得到的標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增效率及擬合度較好，選擇的5個或6個點(diǎn)均勻分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線上，可以用于表達(dá)量定量的分析。 熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性在熒光定量PCR擴(kuò)增程序中，設(shè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。熒光定量PCR反應(yīng)完成后，將反應(yīng)產(chǎn)物溫度降低到55℃，℃，同時實(shí)時檢測SYBR Green的熒光信號強(qiáng)度。隨著溫度升高，DNA雙鏈打開，熒光信號逐漸降低。當(dāng)DNA解鏈時，熒光信號強(qiáng)度降急劇降，此時的溫度為融解溫度(Tm)。對于某一特定的產(chǎn)物，其DNA鏈的長度和C+G含量決定其Tm，因此其Tm值固定。通過對擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值分析，可以衡量擴(kuò)增的特異性（如圖3）。AB圖3 IGFBP6和βactin基因的擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線 Melt curve of IGFBP6 and βactin gene amplification product結(jié)果表明：各個基因擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線均為單峰曲線。表明各個基因的熒光定量PCR擴(kuò)增過程中，沒有非特異性產(chǎn)物和引物二聚體形成，擴(kuò)增過程的熒光信號均為特異擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號。 IGFBP6基因的表達(dá)差異 IGFBP6基因的性別表達(dá)差異IGFBP6基因的性別表達(dá)在不同時間段器官中存在差異，如表5和圖5 。IGFBP6基因在在出生0d的背最長肌組織中mRNA的表達(dá)量、在出生90d的半膜肌中、出生后120d的肝臟和心臟組織中在公母羊之間存在極顯著差異（P），在出生后90d的肝臟和心臟組織中mRNA的表達(dá)量在公母羔羊之間存在顯著差異（P＜）。在肝臟、心臟、肺臟、肌肉組織中，其他各時間點(diǎn)IGFBP6基因表達(dá)量在性別之間差異不顯著（P＞）。 IGFBP6基因的組織表達(dá)差異 根據(jù)出生后各階段不同組織IGFBP6基因表達(dá)量的差異，如圖4，基本呈現(xiàn)背最長肌表達(dá)量最高，IGFBP6基因表達(dá)量總是極顯著高于其他組織（P＜），其次為肺臟和心臟組織，其它組織的表達(dá)量最低。另外，肺臟組織在出生后30d的IGFBP6基因表達(dá)量是極顯著高于除背最長肌外其他組織（P＜），心臟組織在出生后0d、90d和120d的IGFBP6基因表達(dá)量是極顯著高于除背最長肌外其他組織（P＜），在出生后120d，肺臟中IGFBP6基因表達(dá)量顯著高于除背最長肌外其他組織（P＜）。圖4 IGFBP6基因的組織表達(dá)差異 The difference of relative expression of IGFBP6 gene in six tissues16表4 IGFBP6基因的表達(dá)差異 The difference of relative expression of IGFBP6 gene in six tissues注：A：肝臟；B：肺臟；C：心臟；D：背最長??；E：半膜??；F：臂三頭??；。Note：A：liver；B：lung；C：heart；D：longissimusdorsi；E：semimembranosus；F：musculustriceps；A肝臟日齡Day表達(dá)量均值Expression of Mean公母均值Male and Female of Mean標(biāo)準(zhǔn)誤Standard Error of Mean0d ♀ ♂30d ♀ ♂60d ♀ ♂90d ♀ ♂120 ♀ ♂B肺臟日齡Day表達(dá)量均值Expression of Mean公母均值Male and Female of Mean標(biāo)準(zhǔn)誤Standard Error of Mean0d ♀ ♂ 30d ♀ ♂60d ♀ ♂90d ♀ ♂120 ♀ ♂C心臟日齡Day表達(dá)量均值Expression of Mean公母均值Male and Female of Mean標(biāo)準(zhǔn)誤Standard Error of Mean0d ♀ ♂30d ♀ ♂60d ♀ ♂90d ♀ ♂120 ♀
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1