【文章內容簡介】 數差度對質粒載體穩(wěn)定性的影響。 差度：不同細胞個體之間的質粒載體的拷貝數的差 異程度，可影響質粒載體丟失的速率。 差度越大穩(wěn)定性越差；差度越小穩(wěn)定性越高。 寄主重組體系對質粒載體穩(wěn)定性的效應 在野生型的大腸桿菌細胞中，質粒重組的重要結果是形成質粒寡聚體，它也是造成質粒載體不穩(wěn)定的原因之一。 質粒 DNA分子之間的重組頻率； 含質粒寡聚體細胞的生長速率。 影響質粒重組的突變也會影響質粒的穩(wěn)定性。 第二節(jié) 噬菌體載體 （ Bacteriophage，簡稱 phage） 一、 噬菌體的一般生物特性 可脫離寄主細胞生存，但不能進行復制。 除了對寄主的依賴性，還具備其它的功能： 保護自己的核苷酸分子（ DNA、 RNA）免遭環(huán)境化學物質的破壞； 將其核苷酸分子注入到被感染的細菌細胞； 將被感染的細菌細胞轉變成制造噬菌體的體系，從而長生出大量的子代噬菌體顆粒； 使感染的細菌細胞釋放出子代的噬菌體顆粒 1. 噬菌體的結構和其核酸類型 ： 結構： 無尾部結構的二十面體型、 具尾部結構的二十面體型、 線狀體型 核酸類型：最常見的是雙鏈線性 DNA、 雙鏈環(huán)形 DNA、 單鏈環(huán)形 DNA、 單鏈線形 DNA、 單鏈 RNA。 不同的噬菌體之間的核酸分子量的差異也是比較大的。大分子量的噬菌體生命周期比較復雜；對寄主的依賴性較低。 有些噬菌體的 DNA堿基不是由標準的A/T/C/G組成的。 Example： T4噬菌體 DNA沒有 C堿基，取代的是 5羥甲基胞嘧啶（ HMC） 。SP01噬菌體 DNA中沒有 T堿基，取代的是 5羥甲基尿嘧啶（ HMU）。 噬菌體的生命周期分為溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生長周期的噬菌體顆粒叫烈性噬菌體。 烈性噬菌體溶菌生長的基本過程： 吸附 吸附到位于感染細胞表面的特殊接受器上 注入 噬菌體 DNA穿過細胞壁注入寄主細胞 轉變 被感染的細胞成為制造噬菌體顆粒的場所 合成 大量合成噬菌體特有的核酸和蛋白質 組裝 包裝了 DNA頭部和尾部組裝成噬菌體的顆粒 釋放 合成的子代噬菌體顆粒從寄主細胞內釋放出來 溶源生長周期： 是指在感染過程中沒有產生出子代 噬菌體顆粒，噬菌體的 DNA是整 合到寄主細胞染色體 DNA上，成 為它的一個組成部分。 現知道只有雙鏈 DNA的噬菌體才具有溶源周期 溫和噬菌體：既能進入溶菌生命周期又能進入溶 源生命周期。 溶源性細菌：具有一種完整的噬菌體基因組的細菌 溶源化： 用溫和噬菌體感染細菌培養(yǎng)物使之形成溶 源性細菌的過程 整合： 噬菌體的 DNA是被包容在寄主細胞染色體 DNA中 原噬菌體：在溶源細菌內存在的整合的或非整合的 噬菌體 超感染免疫性：溶源性細菌不能夠被頭一次感染并 使之溶源化的同種噬菌體再感染。 溶源周期的主要特征： λ 噬菌體和 P1噬菌體 λ 噬菌體的特征： 噬菌體的 DNA分子注入細菌細胞 經過短暫的轉錄之后，需要合成一種整合酶，于是轉錄活性便被一種阻遏物所關閉 噬菌體的 DNA分子插入到細菌染色體基因組DNA上，變成原噬菌體 細菌繼續(xù)生長、增值，噬菌體的基因作為細菌染色體的一部分進行復制。 噬菌體 P1基本特征： 不存在噬菌體 DNA分子的整合作用體系，而是變成了一種進行獨立復制的環(huán)形的質粒 DNA分子。 溶源噬菌體的誘發(fā)： 依賴于阻遏基因與操縱基因的相互作用。阻遏物被一種蛋白酶切割，失活，使噬菌體轉錄。 需要刪除酶將噬菌體的 DNA從大腸桿菌染色體上刪除下來，使之形成環(huán)形的 DNA分子，恢復溶源周期開始時的狀態(tài)。 二、 λ噬菌體載體 λ phage kb in length ?Linear or circular genome (cos ends) 溶菌階段 (復制和釋放 ) 溶源階段 (整合到寄主染色體上 ) A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII N COS COS 頭部基因 尾部基因 功能不明區(qū) 溶源化 重組 早期控制 阻遏 DNA合成 溶菌 生長非必須區(qū)段 cI基因：溶源過程控制基因。 λ噬菌體的基因組結構 DNA Protein coat cos cos Nonessential region Long (left) arm short (right) arm Exogenous DNA (~2023 kb) λ phage 12bp 5?CGGGGCGGCGACCTCG3‘ 3‘GCCCCGCCGCTGGAGC5‘ Cleavage Ligation (during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG3‘ 5‘CG + GC5‘ 3‘GCCCCGCCGCTGGA The phage ? cos ends Circular form Linear form ? Viruses that can infect bacteria. ? kb in length ?Linear or circular genome (cos ends) λ phage Lytic phase (Replicate and release) Lysogenic phase (integrate into host genome) λ噬菌體載體的主要類型 1. 插入式載體 一種只具有一個可供外源 DNA插入的克隆位點的 派生載體。 2. 替換型載體（取代型載體） 具有成對的克隆位點，在這 兩個位點之間的 λDNA區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代。 3. 凱倫噬菌體載體 插入式載體： λ 噬菌體載體相對于質粒載體來說，克隆片段較大，所以一般用于 cDNA文庫或基因組文庫的構建。 ?cI基因插入失活：如 λ gt10 、 λNM1149 等載體，在 cI基因上有 EcoR I及 Hind III的酶切位點。外源基因插入后將導致 cI基因的失活。 cI基因失活后將導致噬菌體不能溶原化，產生清晰的噬菌斑。相反，產生混濁的噬菌斑。 ?Lac Z基因插入失活：如 charon16A載體，在非必須區(qū)段引入 lac Z基因，在 lac Z基因上有 EcoR I位點，插入失活后利用 Xgal法篩選（蘭白篩選）。 cI EcoR I LA λgt 10 lac Z LA EcoR I Charon 16A λ 替換型載體（取代型載體） ? 外源 DNA取代噬菌體染色體中對于噬菌體的感染和復制非必要的片段 (~ 20 kb) ? 高感染效率 (109 轉化株 /ug 載體 DNA, 比質粒高 100倍 ) . EMBL3, ?DASH 替換式載體 野生型噬菌體染色體的中段對于噬菌體的感染和復制是非必要的 ， 外源 DNA可以取代這一片段 ， 例如Charon 4A、 λEMBL 3/ Charon40等載體 ， 這些載體是用 Lac 5（ 乳糖操縱子的大部分系列 ， 包括完整的 Lac Z） 替換入噬菌體的中間區(qū)段 ， 同時將 Lac 5作為選擇標記 ， 使用時用 EcoRI水解 ， 去掉中間的片段 ，再與欲克隆片段在體外進行重組 、 包裝 。 而后 ， 感染 ， 并裂解 ， 形成空斑 。 換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體 。 Lac 5 EcoR I EcoR I EcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4A EMBL3/4 Charon 40 替換型載體克隆外源 DNA的步驟 1. 應用適當的核酸內切酶消化 λ 載體， 除去可取代的 DNA片段； 2. 將上述所得的 λDNA 載體臂同外源 DNA片段的連接； 3. 對重組體的 λDNA 分子進行包裝和增 殖，以得到有感染性的 λ 重組噬菌體 λ 取代載體 2. 組裝 . 1. 連接 3. 侵染 體外包裝 λ 噬菌體 DNA體外重組后，一般必須經過體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組 DNA導入 。這是因為以 感染 方式導入細胞的頻率可達106~108/μgDNA ，而以 轉染 （ translation）的方式導入的頻率僅為 103~105/ μgDNA 。 λ 噬菌體的包裝限制為野生噬菌體 DNA（約 kb）的 75%~105%。 由于 λ 噬菌體包裝時，當 DNA的長度短于野生型的 78%或超過 105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型 DNA（ ）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求 λ 載體 DNA和外源 DNA長度之和在 39～53kb之間。 插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較替換式為小。 凱倫噬菌體載體 既有插入型；又有替換型 在基因工程實驗中的用途十分廣泛 承受外源 DNA的能力：幾個 kb到 23kb （左右臂連接） （三段自身連接） （插入片段） 根據噬菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選 三、單鏈 DNA噬菌體載體 (M13) 單鏈 DNA噬菌體載體 M1 f fd。 優(yōu)越性： 1. 單鏈 DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的 DNA為媒介的，這種復制形式 的 DNA簡稱 RFDNA； 2. 不論是 RFDNA還是 ssDNA都能感染大腸桿菌； 3. 單鏈 DNA噬菌體顆粒的大小，是受其 DNA的多制約的，不存在包裝限制 問題； 4. 容易測定外源 DNA片斷的插入取向； 5. 可產生含外源片斷的單鏈 DNA分子。 M13噬菌體載體 M13是一種含單鍵（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。這類載體主要用來獲得大量的單鏈ＤＮＡ片段，這種單鏈ＤＮＡ片段在遺傳學研究中主要用來測定ＤＮＡ序列（ sanger雙脫氧法）、基因的定點突變研究、異源雙鏈 DNA的分