【文章內(nèi)容簡介】 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體 不會(huì)轉(zhuǎn)錄非必須基因 ，不必浪費(fèi)源量和能量、不會(huì)干擾正常的表達(dá)。 增加載體的拷貝數(shù)會(huì)增加轉(zhuǎn)錄出的 mRNA數(shù)目。增加表達(dá)效率。 4. 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達(dá)效率的影響 但過度的外源基因的表達(dá)會(huì)影響宿主的正常生長。 1. 選擇強(qiáng)啟動(dòng)子序列，如 tac 等 七、提高表達(dá)水平常用的方法 2. 調(diào)整 SD序列與 AUG堿的距離 距離過長或過短都影響真核基因的表達(dá)。根據(jù)不同的啟動(dòng)子選擇不同的距離。 3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子 一般為 59bp。 能提高翻譯的起始效率。 4. 增加 mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 在外源基因的下游插入 “ 重復(fù)性基因外回文序列 ” 能防止 mRNA受到 3’?5’外切酶的攻擊。 5. 減輕宿主細(xì)胞的代謝負(fù)荷 合理地調(diào)節(jié)代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系。 將宿主生長代謝與外源基因表達(dá)分開。 （ 1）誘導(dǎo)表達(dá) 一般采用溫度誘導(dǎo)或藥物誘導(dǎo)。 cI857阻遏物有活性，抑制 ?PL啟動(dòng)子，外源基因不表達(dá)，宿主大量生長。 32176。 C: 42176。 C: cI857阻遏物失活， PL啟動(dòng)子啟動(dòng)，外源基因高水平表達(dá)，宿主生長受到限制。 cI857 PL 外源基因 PO ?PL啟動(dòng)子是溫度誘導(dǎo)型 調(diào)節(jié)基因 lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。 無 IPTG: 阻遏物與 lac操縱基因結(jié)合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。 有 IPTG: 阻遏物與 IPTG結(jié)合， lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。 tac啟動(dòng)子是藥物誘導(dǎo)型 （ 2）表達(dá)載體誘導(dǎo)復(fù)制 將宿主的生長與載體的復(fù)制分開。 當(dāng)宿主大量 生長后 ，再誘導(dǎo)載體制粒的復(fù)制，增加拷貝數(shù)。 當(dāng)需要宿主大量 生長時(shí) ，抑制載體質(zhì)粒的復(fù)制。 N末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。 （ 1）設(shè)計(jì)成融合蛋白 這是避免被降解的最好措施。 質(zhì)粒基因產(chǎn)物 目的基因產(chǎn)物 N C 切割 6. 提高表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 防止被宿主的蛋白水解酶降解。 ① 使用次黃嘌呤核苷（ lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。 ② 大腸桿菌的 htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 ③ T4噬菌體的 pin基因產(chǎn)物能抑制細(xì)菌的蛋白酶。可把 pin增加到載體上。 （ 2） 使用突變菌株，保護(hù)外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的蛋白酶的表達(dá)。 （ 3）表達(dá)分泌蛋白 細(xì)胞質(zhì) 外膜 內(nèi)膜 周間質(zhì) 質(zhì)粒 染色體 “外排 ” ： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “ 分泌 ” ： 蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。 八、外源蛋白質(zhì)表達(dá)后的正確修飾 分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵，二硫鍵異構(gòu)酶催化，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。 1. 形成正確的二硫鍵 人胰島素分子 抗體分子 人血紅蛋白分子 如信號(hào)肽、內(nèi)含肽（ intein）等序列的切割。 2. 前體切割 （ 1） O糖基化（ Ser, Thr） 增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和某些特殊性質(zhì)。 3. 蛋白質(zhì)糖基化 （ 2） N糖基化（ Asn） 4. 氨基酸殘基的修飾 磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、軟脂化 缺乏蛋白質(zhì)的加工。 （如糖基化、氨基酸修飾等）。 九、原核細(xì)胞表達(dá)的缺陷 酵母菌、植物原生質(zhì)體、動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞等。 第二節(jié) 外源基因在真核細(xì)胞中的表達(dá) 真核或病毒啟動(dòng)子 MCS PolyA信號(hào) 終止子 外源基因 ① 能在 。 1. 酵母克隆載體 一、在酵母中表達(dá) Leu2+、 His+、 Ura3+、 Trp1+。 ④ 有合適的克隆位點(diǎn)。 ③ 有酵母的選擇標(biāo)記 Ori ② 有 大腸桿菌的選擇標(biāo)記 Ampr、 Tetr。 Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells 由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的 DNA片斷（選擇標(biāo)記）構(gòu)成。 ColE1 酵母 Leu 2+ 如 PYeleu10: （ 1）整合型載體 (YIp) ① 轉(zhuǎn)化率低（ 110轉(zhuǎn)化子 /微克 DNA）。 特點(diǎn)： 載體上只有細(xì)菌的復(fù)制區(qū)，沒有酵母的自主復(fù)制區(qū)。 可與受體細(xì)胞的染色體 DNA同源重組，隨染色體一起復(fù)制。 ② 不能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制 ③ 整合到酵母的染色體上 ④ 不能從酵母細(xì)胞中提取載體。 由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的 DNA片斷 (選擇標(biāo)記和酵母 DNA自主復(fù)制順序 ARS）構(gòu)成。 大腸桿菌質(zhì)粒 酵母 ARS （ 2）復(fù)制型載體 (YRp) 酵母選擇標(biāo)記 ARS ARS（ automously replicating sequence） : ATTTTATATTTA T G T 250bp 保守區(qū) 特點(diǎn)： ① 轉(zhuǎn)化率高（ 102103轉(zhuǎn)化子 /微克 DNA) 。 ④ 不穩(wěn)定，容易丟失。 ② 可從大腸桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。 既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母細(xì)胞中自主復(fù)制。 ③ 穿梭載體（ shuttle vector） 在 YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的 著絲粒區(qū) 。 特點(diǎn)： YRp質(zhì)粒 酵母著絲粒 （ 3）著絲粒質(zhì)粒 (YCp) ③ 不易從細(xì)胞中提取。 ① 行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。 ② 單拷貝存在。 由大腸桿菌質(zhì)粒、 2?m質(zhì)粒 及酵母染色體 DNA選擇標(biāo)記構(gòu)成。 大腸桿菌質(zhì)粒 酵母選擇標(biāo)記 2?m質(zhì)粒 如 pYF92: pBR322 2?m 酵母 his 3+ （ 4）附加體型載體 (YEp) 2?m質(zhì)粒： 釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)粒，長度是 2?m 。含有自主復(fù)制起始區(qū) ori和 STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。 特點(diǎn)： ① 很高的轉(zhuǎn)化活性（ 103105轉(zhuǎn)化子 /微克 DNA） . ② 拷貝數(shù)多（ 25100分子 /細(xì)胞）。 ③ 比 YRp穩(wěn)定。 YEp24 Leu 酵母 原生質(zhì)體 感受態(tài) 酶去壁 CaCl PEG 整合到染色體上， 或獨(dú)立在酵母細(xì)胞內(nèi) 轉(zhuǎn)化 Leu營養(yǎng)缺陷型 培養(yǎng)基篩選 轉(zhuǎn)化子克隆生長 酵母載體 大腸桿菌 提取 插入外源基因 鑒定克隆 發(fā)酵表達(dá) 外源基因產(chǎn)物 分離、純化 2. 酵母轉(zhuǎn)化和表達(dá)的一般過程 （ 1）優(yōu)點(diǎn) ① 對其遺傳學(xué)和生理學(xué)的研究比較深入。 ② 小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應(yīng)器中都能生長。 ③ 已經(jīng)分離出很強(qiáng)的啟動(dòng)子。 ④有 翻譯后的加工。 ⑤ 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純 化。 ⑥ 安全性高（ FDA確認(rèn)的安全生物），不 需要宿主的安全性檢驗(yàn)。 3. 酵母表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn) ② 常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。 ③ 重組蛋白常常超糖基化 ① 表達(dá)量普遍低。 （ 2）缺點(diǎn) 每個(gè) N寡糖鏈上含有 100多個(gè)甘露糖， ④ 分泌困難。 正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有 813個(gè)甘露糖。 分泌型蛋白有時(shí)會(huì)留在 壁膜 間隙， 診斷試劑 丙肝病毒蛋白 HIV1抗原 種類 名稱 疫苗 乙肝病毒表面抗原 瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白 HIV1外殼蛋白 4. 在啤酒酵母中表達(dá)的重組蛋白 人類治療用蛋白藥物 上皮生長因子 胰島素 類胰島素生長因子 血小板源生長因子 胰島素前體 成纖維細(xì)胞生長因子 集落刺激因子 ?1抗胰蛋白酶 凝血因子 VIIIa （ 1）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá) 例：人 Cu/ZnSOD在酵母中表達(dá)： 5. 在啤酒酵母中表達(dá)外源蛋白的方式 超氧化物 H+ H2O2 H2O 過氧化物酶 表達(dá)出的 SOD修飾正確： 起始氨基酸被切掉， 第二個(gè)氨基酸丙氨酸也被乙?；? SOD(超氧化物歧化酶 ) 宿主： 亮氨酸合成缺陷型酵母。 GAPD： 甘油醛磷酸脫氫酶 （ 2）表達(dá)分泌型蛋白 在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。 需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。 方法： 構(gòu)建載體 在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子 a1的前導(dǎo)肽，與重組蛋白的 N端通過 LysArg相連。 前導(dǎo)肽（ leader peptide）： 蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時(shí)，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶 識(shí)別這個(gè)切點(diǎn)信號(hào)，把重組蛋白正確切下來。 信號(hào)肽的切割： 前導(dǎo)肽 LysArg 重組蛋白（水蛭素） 內(nèi)切蛋白酶 （ 1） 乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表達(dá) 在大型發(fā)酵反應(yīng)器中容易生長； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇時(shí)，表達(dá)的 乙醇氧化酶 高達(dá)胞內(nèi)總蛋白的 40