【文章內(nèi)容簡介】 改造后 一、 λ噬菌體克隆載體 （一） λ 噬菌體性質(zhì) λDNA + 外殼蛋白 λDNA () 噬菌體中：線性 宿主細胞：環(huán)狀 (cos位點 ) λ 噬菌體基因組有基因 50個以上 J與 N、 P與 Q之間為非必需序列 限制性核酸內(nèi)切酶位點 : 56種（ p477） λ 噬菌體的生長途徑 溶菌生長途徑 溶原生長途徑 → 某種脅迫條件下 → 合成 six 基因產(chǎn)物 → λ DNA 脫離細菌染色體 → 溶菌 （二）構建依據(jù) λ 噬菌體是一種溫和噬菌體 能承載較大的外源 DNA片段 λDNA 頭部可包裝約 ～ 51kb(自身的 75%～ 105%)，且約有 20kb λDNA 可缺失（生長非必需） 在 λDNA 上有多種限制性內(nèi)切酶位點 （三）構建的基本策略與技術路線 ? 策略 : 切去部分非必需區(qū)，刪掉多余的限制性內(nèi)切酶位點，插入選擇性標記基因，建立體外包裝系統(tǒng)。 ? 技術路線 用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識別位點 選定一種酶，以 g t WES – λ β 為例， EcoRI（如圖）。 （ ） λDNA E co R I 6個片段 其中： B片段是 λ 噬菌體生長非必需的； C片段缺失可阻斷溶原生長途徑，但不影響溶菌途徑； E片段去掉 min5序列（ ）。 兩端 E coR I別點經(jīng)點突變或甲基化處理，即得 g t WES–λ β ：（ = ） 克隆能力： 替換 B： 最大： 51()= 最?。?()= 實際應用時克隆能力略有出入（ p109,表 35） 在 λDNA 的非必需區(qū)內(nèi)插入選擇標記基因 （ 1）取代 red和 gam基因 外源 DNA取代 獲 Spi表型 在 P2噬菌體溶原性細胞中能生長 野生型 λ 噬菌體 (Spi+表型 ) 在 P2噬菌體溶原性細胞中不能生長 局限性：只能以 P2噬菌體溶原細胞作為受體 （ 2）最常用的篩選標記： Lac Z基因 建立重組 λDNA 分子體外包裝系統(tǒng) 體外重組 DNA分子必須經(jīng)體外包裝成噬菌體顆粒后，才能轉導受體細胞。 野生型 λ 噬菌體感染的細胞中無多余的外殼蛋白。 D（ D基因缺失噬菌體） → 受體細胞 → 積累除 D蛋白以 外所有蛋白質(zhì) E（ E基因缺失噬菌體） → 受體細胞 → 積累除 E蛋白以 外所有蛋白質(zhì) 混合 D、 E互補 包裝 λDNA 分子 → λ 噬菌體 如 :菌株 BHB2688(E )+ BHB2690(D) （四） λ 噬菌體克隆載體的應用 建立 c DNA基因文庫 克隆外源目的基因 （五）重組 λDNA 分子的體外包裝（自學） 二、 cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體） （一）構建策略 由質(zhì)粒和含 cos位點的 λDNA 片段組裝成的載體，即 cosmid （二） cosmid的特征 環(huán)形雙鏈 DNA分子 , ≤ , 一般＜ 10kb 具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復制 含有一個 cos位點 A蛋白 cos末端 → 體外包裝成為噬菌體，但不含λ 噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和 DNA復制系統(tǒng)，不會產(chǎn)生子代噬菌體 cosmid較小，可承載更大的外源 DNA 若 cosmid為 ，則可承載 ()kb外源 DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒 。 因此， cosmid克隆廣泛用于構建基因組文庫。 （三） 使用 cosmid載體的基本程序 利用 cosmid的質(zhì)粒性質(zhì)，可按質(zhì)粒操作轉化受體細胞 利用 cosmid的 λ 噬菌體性質(zhì) → 轉導受體細胞（下圖） 三、 M13噬菌體克隆載體 （一） M13 DNA 絲狀噬菌體，內(nèi)有一環(huán)狀單鏈 DNA分子（ “ +‖鏈 DNA） 大小： 結構： 10個區(qū) 基因間隔區(qū)（ IS區(qū)） 含復制起始位點及可插入外源DNA的位點 （二） M13DNA復制和 M13噬菌體增殖 M13 DNA―+‖鏈進入 雄性大腸桿菌 → 合成 “ ‖鏈 → 產(chǎn)生雙鏈 M13 DNA（復制型 DNA或 RFDNA） → 按環(huán)狀雙鏈 DNA方式復制，同時以 “ +‖鏈 DNA為模板轉錄包裝蛋白 → RFDNA達 200拷貝時，單鏈 DNA特異結合蛋白與 “ +‖鏈結合而阻斷合成 “ ‖鏈 → 結果只能以 “ ‖鏈為模板合成 “ +‖鏈 → “ +‖鏈 DNA被包裝蛋白包裝成新的 M13噬菌體 → 擠出受體細胞 → 宿主細胞不被溶菌。 M13 DNA復制特征：以雙鏈 DNA為中間媒介 培養(yǎng)物 → 高速離心 → 上清中含噬菌體顆粒 → “ +‖鏈 DNA 沉淀菌體 → 破碎后，可提取 RFDNA （三） M13噬菌體克隆載體的構建策略和途徑 策略： 在 RFDNA的 IS區(qū)插入選擇標記基因，并組裝合適ＭＣＳ。 RFDNA上有 10個 B su I位點 → 部分酶切 → 獲得全長線形 RFDNA, 與含 LacZ`標記的 HindⅢ 酶切片段進行平末端連接 → M13mp1載體。為獲得合適的克隆位點 ,可在 Lac Z`區(qū)插入ＭＣＳ連桿 構建成對 M13載體，保證外源 DNA兩條鏈都能隨 “ +‖鏈一起復制包裝。 （四） M13克隆載體的優(yōu)點與應用 優(yōu)點： 以雙鏈環(huán)形 DNA為中間媒介復制，可與質(zhì)粒一樣體外純化操作 制備的 M13 DNA單、雙鏈都能轉化大腸桿菌，直接轉染受體細胞 單鏈 DNA不受包裝限制，可包裝 M13 DNA分子 6倍的 DNA分子 可產(chǎn)生大量純化的含外源 DNA插入的單鏈 DNA分子 主要用途：克隆、分離單鏈外源 DNA片段 獲得的 “ +‖鏈可直接用于 DNA測序 四、 Ca MV克隆載體 花椰菜花葉病病毒（ CaMV） 環(huán)狀雙鏈 DNA分子 （一） CaMV DNA分子 大小： 8kb 結構：在病毒顆粒中呈開環(huán)形式，負鏈有一缺口， 正鏈有兩缺口。進入植物細胞后單鏈部分被 酶解，缺口自行閉合，成為環(huán)狀 DNA分子。 （二） Ca MV基因區(qū) ? 8個閱讀框（ ORF）和 3個間隔區(qū)（ IR1～ 3） IR1－ ORF VI與 ORF VII之間 IR2－ ORF VII與 ORF