【正文】 相同的38S RNA（右圖） 。 （二） Ca MV基因區(qū) ? 8個閱讀框（ ORF）和 3個間隔區(qū)（ IR1～ 3） IR1－ ORF VI與 ORF VII之間 IR2－ ORF VII與 ORF I之間 IR3－ ORF V與 ORF VI之間 IR1 和 IR3區(qū)各有一個啟動子結構，分別啟動同方向轉錄35S RNA和 19S RNA，而兩者的終止子都在 IR1區(qū)。 RFDNA上有 10個 B su I位點 → 部分酶切 → 獲得全長線形 RFDNA, 與含 LacZ`標記的 HindⅢ 酶切片段進行平末端連接 → M13mp1載體。 D（ D基因缺失噬菌體） → 受體細胞 → 積累除 D蛋白以 外所有蛋白質 E（ E基因缺失噬菌體） → 受體細胞 → 積累除 E蛋白以 外所有蛋白質 混合 D、 E互補 包裝 λDNA 分子 → λ 噬菌體 如 :菌株 BHB2688(E )+ BHB2690(D) （四） λ 噬菌體克隆載體的應用 建立 c DNA基因文庫 克隆外源目的基因 （五）重組 λDNA 分子的體外包裝（自學） 二、 cosmid克隆載體（柯斯質粒載體） （一）構建策略 由質粒和含 cos位點的 λDNA 片段組裝成的載體，即 cosmid （二） cosmid的特征 環(huán)形雙鏈 DNA分子 , ≤ , 一般＜ 10kb 具有質粒的性質，可轉化大腸桿菌，并按質粒方式復制 含有一個 cos位點 A蛋白 cos末端 → 體外包裝成為噬菌體，但不含λ 噬菌體溶菌生長途徑、溶原生長途徑和 DNA復制系統(tǒng)，不會產(chǎn)生子代噬菌體 cosmid較小，可承載更大的外源 DNA 若 cosmid為 ，則可承載 ()kb外源 DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒 。 ? 技術路線 用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識別位點 選定一種酶，以 g t WES – λ β 為例， EcoRI（如圖）。 簡述 Lac Z`的篩選機制。 圖 310 A型酵母 2μm 質粒 b、 20～ 80個 /細胞。 共整合克隆載體系統(tǒng)（ TDNA同源序列、 bom 位點） 雙元克隆載體系統(tǒng) ——微型 Ti質粒 （ 四）乳酸桿菌質?？寺≥d體 乳酸桿菌： G+，非致病，益菌生，用于食品和飲料。 Onc Ti： TDNA上的onc基因被取代而構建。 Ti質粒克隆載體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。 用野生型 Ti質粒獲得的轉基因植物細胞只能分裂，不能分化為植株，故不能直接選育轉基因植物。 4個功能區(qū)： TDNA區(qū)、 Vir區(qū)、 Con區(qū)、 Ori區(qū) （ 1） TDNA區(qū) Ti質粒進入植物細胞的約 25kb部分，即 TDNA （ transfer DNA)。圖 33。 ? 顯性質粒 Ｒ質粒： 含有氨芐青霉素 Ap、氯霉素 Cm、卡那霉素 Km、四環(huán)素 Tc、鏈霉素 Sm等藥物的抗性基因，可作為選擇標記。 rep基因 ：指令宿主合成一種調節(jié)蛋白，促進質粒的復制 par序列 ：附著在細胞膜上，使質粒隨細胞分裂而正確地分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù) ４、質粒的不親合性 ? 親和性質粒：能在同一細胞中復制的幾種質粒 不親和性（不相容性）質粒：不能在同一細胞中復制的質粒 ? 意義：宿主細胞內的原有質粒與克隆載體的質粒必須是親和性質粒，最好不含內源性質粒 ５、質粒遷移 （１）接合質粒： 含 tra基因 → 合成細胞表面物質（鞭毛） → 質粒 DNA入受體細胞 含 tra基因的質粒稱為 接合質粒 。 按克隆載體的來源分： 質?！? 病毒或噬菌體～ 質粒與病毒或噬菌體 DNA組成的～ 質粒與染色體 DNA片段組成的～ 按應用范圍分： 表達型～ 啟動子探針型～ cDNA ～ 按應用對象分： 原核生物～ 植物～ 動物～ 分 類 ３ .１ 質?？寺≥d體 定義： 以質粒 DNA為基礎構建而成的載體，適于原核和植物的基因轉移、建立基因組文庫和 c DNA基因文庫。3 基因克隆載體 定義 通過不同途徑將承載的外源 DNA片段（基因）帶入受體細胞且能在其中維持的 DNA分子。 有選擇克隆子的標記基因 安全性 (不含損害受體的基因 ,不任意轉入別的 ,尤其人的細胞 ) 意義： 基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構建新載體一直是基礎研究的優(yōu)先領域。 （２）質粒復制的控制因素 cop基因 ：指令宿主合成阻遏物，當質粒復制到一定拷貝數(shù)時，阻遏物也合成積累，直到阻止質粒的繼續(xù)復制。這種現(xiàn)象稱～ 質粒的遷移作用 ６、顯性質粒和隱蔽質粒 ? 宿主因含某種質粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱為顯性（表達型）質粒。插入失活（圖解） Ⅱ 、 pUC18/19質粒載體 ? 與 pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個 DNA片段（ lac Z`基因） 替換 Tcr基因；組裝了一個多克隆位點（ MCS）連桿 ? 命名 p UC——University of California的科學家首先構建。雙鏈環(huán)狀 DNA分子，200～ 250kb。 這是 Ti質粒用于遺傳轉化的理論依據(jù)。 （ 4） Ori區(qū) 復制起始區(qū)，調控 Ti質粒自我復制。外源基因以同源交換而重組。 （ 2）中間質粒克隆載體 TDNA的部分序列插入大腸桿菌質粒載體而構建。 標記基因： 選用 lacZ，如有 pLJ1復制啟始位點的 pBG10 選用 ery，如有 p3532復制啟始位點的 pP3537 （五）酵母 2μm 質?？寺≥d體 幾乎所有釀灑酵母中都存在 （ 1） 2μm 質粒結構 a、環(huán)狀分子內有反向重復序列 IR1和 IR2，可發(fā)生重組，形成 A、B型質粒；有 ori復制起始點能自主復制。 ? TA載體的再生方法 （ 1）克隆載體線性化 （ 2）克隆載體末端補平反應 （ 3）克隆載體末端加 T反應 注：再生后的 TA載體，原線性化的酶切位點消失 思考題 名詞解釋：基因克隆載體、遷移作用、接合質粒、MCS、穿梭質粒、 TA克隆 任一 DNA分子都可作為克隆載體使用嗎？為什么？ 構建質粒載體時需考慮哪些特性？講究何策略？遵循什么設計原則？ 指出 pBR322的結構來源，并圖示 pBR322的構建。