【正文】 相同的38S RNA（右圖） 。 （二） Ca MV基因區(qū) ? 8個(gè)閱讀框（ ORF）和 3個(gè)間隔區(qū)（ IR1～ 3） IR1－ ORF VI與 ORF VII之間 IR2－ ORF VII與 ORF I之間 IR3－ ORF V與 ORF VI之間 IR1 和 IR3區(qū)各有一個(gè)啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，分別啟動(dòng)同方向轉(zhuǎn)錄35S RNA和 19S RNA，而兩者的終止子都在 IR1區(qū)。 RFDNA上有 10個(gè) B su I位點(diǎn) → 部分酶切 → 獲得全長(zhǎng)線(xiàn)形 RFDNA, 與含 LacZ`標(biāo)記的 HindⅢ 酶切片段進(jìn)行平末端連接 → M13mp1載體。 D（ D基因缺失噬菌體） → 受體細(xì)胞 → 積累除 D蛋白以 外所有蛋白質(zhì) E（ E基因缺失噬菌體） → 受體細(xì)胞 → 積累除 E蛋白以 外所有蛋白質(zhì) 混合 D、 E互補(bǔ) 包裝 λDNA 分子 → λ 噬菌體 如 :菌株 BHB2688(E )+ BHB2690(D) （四） λ 噬菌體克隆載體的應(yīng)用 建立 c DNA基因文庫(kù) 克隆外源目的基因 （五）重組 λDNA 分子的體外包裝（自學(xué)） 二、 cosmid克隆載體（柯斯質(zhì)粒載體） （一）構(gòu)建策略 由質(zhì)粒和含 cos位點(diǎn)的 λDNA 片段組裝成的載體，即 cosmid （二） cosmid的特征 環(huán)形雙鏈 DNA分子 , ≤ , 一般＜ 10kb 具有質(zhì)粒的性質(zhì)，可轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒方式復(fù)制 含有一個(gè) cos位點(diǎn) A蛋白 cos末端 → 體外包裝成為噬菌體，但不含λ 噬菌體溶菌生長(zhǎng)途徑、溶原生長(zhǎng)途徑和 DNA復(fù)制系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體 cosmid較小，可承載更大的外源 DNA 若 cosmid為 ，則可承載 ()kb外源 DNA，且能被包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒 。 ? 技術(shù)路線(xiàn) 用限制性酶切去非必需區(qū)，抹去多余識(shí)別位點(diǎn) 選定一種酶，以 g t WES – λ β 為例， EcoRI（如圖）。 簡(jiǎn)述 Lac Z`的篩選機(jī)制。 圖 310 A型酵母 2μm 質(zhì)粒 b、 20～ 80個(gè) /細(xì)胞。 共整合克隆載體系統(tǒng)（ TDNA同源序列、 bom 位點(diǎn)） 雙元克隆載體系統(tǒng) ——微型 Ti質(zhì)粒 （ 四）乳酸桿菌質(zhì)?？寺≥d體 乳酸桿菌： G+，非致病，益菌生，用于食品和飲料。 Onc Ti： TDNA上的onc基因被取代而構(gòu)建。 Ti質(zhì)?？寺≥d體真正用于植物而非農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌只起中介作用。 用野生型 Ti質(zhì)粒獲得的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞只能分裂，不能分化為植株，故不能直接選育轉(zhuǎn)基因植物。 4個(gè)功能區(qū)： TDNA區(qū)、 Vir區(qū)、 Con區(qū)、 Ori區(qū) （ 1） TDNA區(qū) Ti質(zhì)粒進(jìn)入植物細(xì)胞的約 25kb部分，即 TDNA （ transfer DNA)。圖 33。 ? 顯性質(zhì)粒 Ｒ質(zhì)粒： 含有氨芐青霉素 Ap、氯霉素 Cm、卡那霉素 Km、四環(huán)素 Tc、鏈霉素 Sm等藥物的抗性基因，可作為選擇標(biāo)記。 rep基因 ：指令宿主合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進(jìn)質(zhì)粒的復(fù)制 par序列 ：附著在細(xì)胞膜上，使質(zhì)粒隨細(xì)胞分裂而正確地分配到子細(xì)胞中，維持相對(duì)穩(wěn)定的拷貝數(shù) ４、質(zhì)粒的不親合性 ? 親和性質(zhì)粒：能在同一細(xì)胞中復(fù)制的幾種質(zhì)粒 不親和性（不相容性）質(zhì)粒：不能在同一細(xì)胞中復(fù)制的質(zhì)粒 ? 意義：宿主細(xì)胞內(nèi)的原有質(zhì)粒與克隆載體的質(zhì)粒必須是親和性質(zhì)粒，最好不含內(nèi)源性質(zhì)粒 ５、質(zhì)粒遷移 （１）接合質(zhì)粒： 含 tra基因 → 合成細(xì)胞表面物質(zhì)（鞭毛） → 質(zhì)粒 DNA入受體細(xì)胞 含 tra基因的質(zhì)粒稱(chēng)為 接合質(zhì)粒 。 按克隆載體的來(lái)源分： 質(zhì)?！? 病毒或噬菌體～ 質(zhì)粒與病毒或噬菌體 DNA組成的～ 質(zhì)粒與染色體 DNA片段組成的～ 按應(yīng)用范圍分： 表達(dá)型～ 啟動(dòng)子探針型～ cDNA ～ 按應(yīng)用對(duì)象分： 原核生物～ 植物～ 動(dòng)物～ 分 類(lèi) ３ .１ 質(zhì)?？寺≥d體 定義： 以質(zhì)粒 DNA為基礎(chǔ)構(gòu)建而成的載體，適于原核和植物的基因轉(zhuǎn)移、建立基因組文庫(kù)和 c DNA基因文庫(kù)。3 基因克隆載體 定義 通過(guò)不同途徑將承載的外源 DNA片段（基因）帶入受體細(xì)胞且能在其中維持的 DNA分子。 有選擇克隆子的標(biāo)記基因 安全性 (不含損害受體的基因 ,不任意轉(zhuǎn)入別的 ,尤其人的細(xì)胞 ) 意義： 基因工程隨載體系統(tǒng)的建立而興起，構(gòu)建新載體一直是基礎(chǔ)研究的優(yōu)先領(lǐng)域。 （２）質(zhì)粒復(fù)制的控制因素 cop基因 ：指令宿主合成阻遏物，當(dāng)質(zhì)粒復(fù)制到一定拷貝數(shù)時(shí)，阻遏物也合成積累，直到阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復(fù)制。這種現(xiàn)象稱(chēng)～ 質(zhì)粒的遷移作用 ６、顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒 ? 宿主因含某種質(zhì)粒而呈現(xiàn)出新的性狀，稱(chēng)為顯性（表達(dá)型）質(zhì)粒。插入失活（圖解） Ⅱ 、 pUC18/19質(zhì)粒載體 ? 與 pBR322區(qū)別：乳糖操縱子的一個(gè) DNA片段（ lac Z`基因） 替換 Tcr基因；組裝了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（ MCS）連桿 ? 命名 p UC——University of California的科學(xué)家首先構(gòu)建。雙鏈環(huán)狀 DNA分子，200～ 250kb。 這是 Ti質(zhì)粒用于遺傳轉(zhuǎn)化的理論依據(jù)。 （ 4） Ori區(qū) 復(fù)制起始區(qū)，調(diào)控 Ti質(zhì)粒自我復(fù)制。外源基因以同源交換而重組。 （ 2）中間質(zhì)?？寺≥d體 TDNA的部分序列插入大腸桿菌質(zhì)粒載體而構(gòu)建。 標(biāo)記基因： 選用 lacZ，如有 pLJ1復(fù)制啟始位點(diǎn)的 pBG10 選用 ery，如有 p3532復(fù)制啟始位點(diǎn)的 pP3537 （五）酵母 2μm 質(zhì)粒克隆載體 幾乎所有釀灑酵母中都存在 （ 1） 2μm 質(zhì)粒結(jié)構(gòu) a、環(huán)狀分子內(nèi)有反向重復(fù)序列 IR1和 IR2，可發(fā)生重組，形成 A、B型質(zhì)粒；有 ori復(fù)制起始點(diǎn)能自主復(fù)制。 ? TA載體的再生方法 （ 1）克隆載體線(xiàn)性化 （ 2）克隆載體末端補(bǔ)平反應(yīng) （ 3）克隆載體末端加 T反應(yīng) 注：再生后的 TA載體，原線(xiàn)性化的酶切位點(diǎn)消失 思考題 名詞解釋?zhuān)夯蚩寺≥d體、遷移作用、接合質(zhì)粒、MCS、穿梭質(zhì)粒、 TA克隆 任一 DNA分子都可作為克隆載體使用嗎？為什么？ 構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)需考慮哪些特性？講究何策略？遵循什么設(shè)計(jì)原則？ 指出 pBR322的結(jié)構(gòu)來(lái)源，并圖示 pBR322的構(gòu)建。