【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 將外源 DNA片段插入在會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因（如 tetr、 ampr、 cmlr等）失活的位點(diǎn)，就有可能通過抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽性克隆的幾率。 正選擇的質(zhì)粒載體 正選擇質(zhì)粒載體（ direct selection vectors）：這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。通過選擇具這種表型特征的轉(zhuǎn)化子，便可大大降低需要篩選的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，從而減輕了實(shí)驗(yàn)的工作量，提高了選擇的敏感性。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 表達(dá)型的質(zhì)粒載體 使克隆在大腸桿菌中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)譯信號(hào)控制之下，并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為 表達(dá)載體（ expression vectors） 。它分為 表達(dá)型質(zhì)粒載體 和 表達(dá)型噬菌體載體 兩種不同的類型。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質(zhì)粒載體 ① pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建 (p93) 由 4 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質(zhì)粒的三個(gè)不同來源的組成部分 ② pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) pSF2124質(zhì)粒易位子 Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ ampr） pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（ tetr） ColE1的派生質(zhì)粒 pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ ori） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 具有較小的分子量， pBR322質(zhì)粒 DNA分子為 4 363bp。 具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)。 具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可累積 1000～ 3000個(gè)拷貝。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pUC質(zhì)粒載體 pUC載體是在 pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其 5′端帶有一段多克隆位點(diǎn)的 lacZ′基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。 pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu) 包括 pUC 1 1 1 1 11 119等 （ i）來自 pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ ori）； 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 （ ii）氨芐青霉素抗性基因（ ampr），但它的 DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識(shí)別位點(diǎn)； （ iii）大腸桿菌 β半乳糖酶基因（ lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼 α肽鏈的 DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為 lacZ′基因； （ iv）位于 lacZ′基因中的靠近 5′端的一段多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 （ 2） pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 如 pUC8為 2 750bP， pUC18為 2686bP。 pUC8質(zhì)粒平均每個(gè)細(xì)胞即可達(dá) 500～ 700個(gè)拷貝。 ① 具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 重組體 pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌 lac操縱子的 lacZ′基因，所編碼的 α肽鏈可參與 α互補(bǔ)作用。因此，在應(yīng)用 pUC8質(zhì)粒為載體的重組實(shí)驗(yàn)中，可用 Xgal顯色的組織化學(xué)方法一步實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子克隆的鑒定。 ② 適用于組織化學(xué)方法檢測(cè) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pUC8質(zhì)粒載體具有與 M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿梭”。 ③ 具有多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段 因此，克隆在 MCS當(dāng)中的外源 DNΑ片段，可以方便地從 pUC8質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移到 M13mp8載體上，進(jìn)行克隆序列的核著酸測(cè)序工作。同時(shí)，也正是由于具有 MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端（如 EcoRI和 BamHI）的外源 DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC8質(zhì)粒載體上。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 T載體與 TA克隆方法 TA克隆方法（ Original TA Cloning Kit）即利用 Taq聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能，在每條 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的 3`端自動(dòng)添加一個(gè) 3`A突出端。 T載體： 一個(gè)線性含 3`T突出端的載體用于直接高效地連接 PCR產(chǎn)物。 Invitrogen公司 TA克隆系統(tǒng) 和 Topo TA克隆系統(tǒng) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 第二節(jié) 病毒（ virus） 質(zhì)粒載體攜帶的外源基因限于以下 構(gòu)建基因組文庫時(shí)，目的 DNA10kb，應(yīng)采用病毒載體。 病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞（ 轉(zhuǎn)導(dǎo) ） ,然后或 自主復(fù)制繁殖 ，或 整合入宿主基因組中潛伏起來 ，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 病毒的上述特性使得它們的 DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋? 高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 大腸桿菌的 λ噬菌體 DNA衍生的載體 黏性質(zhì)粒 載體：含有 λ 噬菌體 DNA的某些位點(diǎn)并被包裝而獲得的載體 M13：小分子的絲狀單鏈?zhǔn)删w 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 1 λ噬菌體 l 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu) l 噬菌體是 大腸桿菌的溫和型噬菌體 l 噬菌體 由外殼包裝蛋白和 lDNA組成 lDNA全長(zhǎng) 48502個(gè)核苷酸 lDNA上 至少有 61個(gè)基因 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體基因組結(jié)構(gòu) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 The phage l cos ends： cos位點(diǎn)（ cohesiveend site，粘性末端位點(diǎn) ） 在 λ噬菌體線性雙鏈 DNA分子的兩端，各有一條由 12個(gè)核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的 5′單鏈突出序列，即通常所說的 粘性末端 。 Circular form Linear form 3′GCCCCGCCGCTGGAGC5′ 5′CGGGGCGGCGACCTCG3′ Cleavage (during packaging) Ligation (after infection) GGGCGGGCGACCTCG3′ GC5′ 5′CG 3′GCCCCGCCGCTGGA 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 占 λ噬菌體 DNA 40－ 50% ，裂解生長(zhǎng)所必須 右臂 約為 810kb ，從 PR 啟動(dòng)子到右側(cè) cos 位點(diǎn)。 左臂 約 20kb ，從基因 A 至基因 J 的區(qū)域，含有編碼噬菌體頭部和尾部蛋白的基因 l 噬菌體基因組至少可編碼 50 個(gè)基因，它們的分布和排列與其功能有一定關(guān)系。根據(jù)執(zhí)行功能可將基因組分為三個(gè)區(qū)。 Right arm Left arm 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體的可取代區(qū)（中間區(qū)或非必需區(qū)） J 基因與 Cro 基因之間的 DNA ， 占 λ噬菌體 DNA 的 1/3 ，主要包含控制 λ噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)的調(diào)節(jié)基因和功能基因。 可被 ga1 基因或 bio 基因替換，不影響 λ 噬菌體裂解生長(zhǎng) 。 Nonessential region 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 DNA Protein coat cos cos Nonessential region Long (left) arm short (right) arm Exogenous DNA (~2023 kb) 12bp λ phage 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體生命周期與溶原狀態(tài) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 整合主要由 λDNA上的 cI和 int兩基因 的產(chǎn)物所激活，而這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì)。 λ噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體 DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為 溶原狀態(tài) 。 DNA重組技術(shù)一般需要 λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài) 人們可以根據(jù)需要改變 λDNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于 溶菌狀態(tài) ，或處于溶菌狀態(tài) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體的選擇性標(biāo)記 lacZ 基因也可用于 λ 噬菌體載體，通過插入或替換載體中的 β半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/Xgal 平板上可通過噬菌斑的顏色，篩選重組噬菌體。 ① lacZ 基因 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ② cⅠ 基因 cⅠ 編碼的 λ抑制子 與操縱區(qū) OR1 和 OR2發(fā)生親和作用結(jié)合后，激活 PRM啟動(dòng) cⅠ 表達(dá) λ抑制子，結(jié)合 Cro及下游裂解蛋白基因的表達(dá)，抑制裂解生長(zhǎng) 溶原 裂解 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 hfl的 中， cⅠ 的表達(dá)使 λ 噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài) hfl+的 中， λ噬菌體可高效率地進(jìn)入溶源狀態(tài) Hfl：高頻溶源化， high frequency of lysogenization 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 重組子中外源基因插入到 cⅠ 中， cⅠ 不能表達(dá) ,將高頻率地使 hfl 進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)，長(zhǎng)出噬菌斑。 在構(gòu)建基因文庫時(shí)，可提高排除非重組噬菌體的效率，從而降低對(duì)基因文庫進(jìn)行篩選的勞動(dòng)強(qiáng)度。 Some of phage plaque 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ③ c Ⅱ 基因 在 hfl－ cⅠ 的產(chǎn)物，高效地進(jìn)入溶源狀態(tài) cⅡ 產(chǎn)物 (cⅡ )結(jié)合 PRE激活 cⅠ 的表達(dá)，生長(zhǎng)向溶原方向進(jìn)行 重組子中外源基因插入到 cⅡ 中， cⅠ 不能表達(dá)，將高頻率地使 hfl 進(jìn)入裂解生長(zhǎng)狀態(tài)，長(zhǎng)出噬菌斑。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ④ Spi 篩選 野生型 λ 噬菌體在帶有 P2 原噬菌體的溶源性 中 的生長(zhǎng)會(huì)受到限制的表型，稱作 Spi+ ，即對(duì) P2 噬菌體的干擾敏感（ sensitive to P2 interference）。 Spi+ 如果 λ 噬菌體缺少兩個(gè)參與重組的基因 red 和 gam ，同時(shí)帶有 chi 位點(diǎn) ，并且宿主菌為 rec + ，則可以在 P2 溶源性 中生長(zhǎng)良好， λ噬菌體的這種表型稱