【正文】 pSC10 F、 RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 質(zhì)粒的不相容性： 分子機(jī)制 兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種 拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同， 兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的 拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定， 因此在經(jīng)過若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一 細(xì)胞內(nèi) 其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 質(zhì)粒 DNA的轉(zhuǎn)移 G－ 細(xì)菌質(zhì)粒 接合型的質(zhì)粒（ conjugative plasmid） 非接合型的質(zhì)粒（ nonconjugative plasmid） 接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如 F、 Col、 R質(zhì)粒等 如 Col、 R的其它成員 非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 F質(zhì)粒 大腸桿菌的某些品系的雄性或供體是被一個(gè)致育因子（ fertility factor）或性因子（ sex factor）決定的 F因子，具有這種因子的能育品系記為 F＋ ，相當(dāng)于雄性。 F+細(xì)胞的 F因子通過接合管向 F－ 細(xì)胞轉(zhuǎn)遞 使 F－ 變成 F＋ ， F因子還可改變細(xì)胞表面的構(gòu)造，以防 F＋ 細(xì)胞間的接合。 R質(zhì)粒編碼一種或數(shù)種抗菌素抗性基因，此種抗性通常能轉(zhuǎn)移到缺乏該質(zhì)粒的受體細(xì)胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Col質(zhì)粒： 此類質(zhì)粒編碼有控制大腸桿菌素合成的基因，即所謂產(chǎn)生大腸桿菌素因子。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 野生型的質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這 使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物 物質(zhì)合成 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿 這些標(biāo)記基因?qū)?DNA重組分子的篩選具有重要意義 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 按其用途可將標(biāo)記基因分為 選擇標(biāo)記基因 篩選標(biāo)記基因 用于鑒別目標(biāo) DNA （載體）的存在，將成功轉(zhuǎn)化了載體的宿主挑選出來 可用于將特殊表型的重組子挑選出來。青霉素可抑制細(xì)胞壁肽聚糖的合成，與有關(guān)的酶結(jié)合并抑制其活性，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。四環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由 399 個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 ② 四環(huán)素抗性基因 （ Tetracycline resistance gene, tetr） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ③ 氯霉素抗性基因 （ chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。 cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白（每個(gè)亞基 23kDa）。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ④ 卡那霉素和新霉素抗性基因 （ kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。） Ⅱ , 25kDa）的基因，氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶可使這兩種抗生素磷酸化，從而干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動(dòng)轉(zhuǎn)移。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 在基因的編碼區(qū)中，若某個(gè)密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)?赭石突變（突變?yōu)? UAA），或琥珀突變（突變?yōu)? UAG），或乳白突變（突變?yōu)? UGA） 。 ⑤ 琥珀突變抑制基因 supF 如果在某一宿主中含具琥珀突變的 tetr 基因和 ampr 基因，只有當(dāng)宿主含有 supF 基因時(shí)才會(huì)對 Amp 和 Tet 具有抗性。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 來自淀粉水解芽胞桿菌 （ Bacillus amyloliquefa ciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。 ⑥ 蔗糖致死基因 SacB 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 篩選標(biāo)記基因 篩選標(biāo)記主要用來區(qū)別重組質(zhì)粒與非重組質(zhì)粒 當(dāng)一個(gè)外源 DNA 片段插入到一個(gè)質(zhì)粒載體上時(shí)，可通過該標(biāo)記來篩選插入了外源片段的質(zhì)粒，即 重組質(zhì)粒 。 ① α互補(bǔ)（ αplementation） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 lacZ′：只編碼 N端 140 個(gè)氨基酸的 lacZ 基因 ，其產(chǎn)物也沒有酶學(xué)活性。 當(dāng)這兩個(gè)無酶學(xué)活性的產(chǎn)物混合在一起時(shí)，可恢復(fù) β半乳糖苷酶的活性，實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)。 若在該 DNA 小片段中再插入一個(gè)片段，將幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無 α互補(bǔ)能力的 β半乳糖苷酶片段。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 異丙基 βD 硫代半乳糖苷 （ IPTG）是乳糖的衍生物，可作為 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，但不能作為反應(yīng)的底物； 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 乳糖既是 lac 操縱子的誘導(dǎo)物，也是作用的底物，乳糖及其衍生物可誘導(dǎo) lacZ 表達(dá)。 底物 Xgal 還可充作生色劑，被 β半乳糖苷酶分解后可產(chǎn)生蘭色產(chǎn)物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。 IPTG誘導(dǎo)該片段的合成，而該片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型 β –半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（ α互補(bǔ)）。 插入失活常被用于檢測含有外源 DNA的重組體，例如若在質(zhì)粒 pBR322的 BamHI的位點(diǎn)插入外源 DNA，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌 (Tets、 Amps)。而那些含有不帶外源基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，則可以在含有四環(huán)素或氨芐青霉素培養(yǎng)基的平板上生長，這樣就很容易篩選到含有目的基因的細(xì)菌，從而淘汰不含目的基因的細(xì)菌。 在大腸桿菌中，常見的要用于基因克隆的天然質(zhì)粒有ColE RSF2124和 pSC101等 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 現(xiàn)行通用的基因克隆載體，絕大多數(shù)就是以質(zhì)粒為基礎(chǔ)改建而成的。如 ColEpMB1或它們的派生質(zhì)粒。例如，pLG33 pLG339及 pHSG415。 （ 1979）首先發(fā)展了失控的質(zhì)粒載體pBEU1和 Pbeu2。 正選擇的質(zhì)粒載體 正選擇質(zhì)粒載體（ direct selection vectors）：這種質(zhì)粒載體具有直接選擇記號并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 表達(dá)型的質(zhì)粒載體 使克隆在大腸桿菌中特定位點(diǎn)的外源真核基因的編碼序列置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)譯信號控制之下，并能在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體特稱為 表達(dá)載體（ expression vectors） 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質(zhì)粒載體 ① pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建 (p93) 由 4 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質(zhì)粒的三個(gè)不同來源的組成部分 ② pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) pSF2124質(zhì)粒易位子 Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ ampr） pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（ tetr） ColE1的派生質(zhì)粒 pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)（ ori） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 具有較小的分子量， pBR322質(zhì)粒 DNA分子為 4 363bp。 具有較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個(gè)細(xì)胞中可累積 1000～ 3000個(gè)拷貝。 pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu) 包括 pUC 1 1 1 1 11 119等 （ i）來自 pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)（ ori）； 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 （ ii）氨芐青霉素抗性基因（ ampr），但它的 DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識別位點(diǎn)； （ iii）大腸桿菌 β半乳糖酶基因（ lacZ）的啟動(dòng)子及其編碼 α肽鏈的 DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為 lacZ′基因； （ iv）位于 lacZ′基因中的靠近 5′端的一段多克隆位點(diǎn)（ MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 （ 2） pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 如 pUC8為 2 750bP， pUC18為 2686bP。 ① 具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù) 重組體 pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌 lac操縱子的 lacZ′基因，所編碼的 α肽鏈可參與 α互補(bǔ)作用。 ② 適用于組織化學(xué)方法檢測 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pUC8質(zhì)粒載體具有與 M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點(diǎn) MCS區(qū)段，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿梭”。同時(shí)，也正是由于具有 MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端（如 EcoRI和 BamHI）的外源 DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到 pUC8質(zhì)粒載體上。 T載體： 一個(gè)線性含 3`T突出端的載體用于直接高效地連接 PCR產(chǎn)物。 病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞（ 轉(zhuǎn)導(dǎo) ） ,然后或 自主復(fù)制繁殖 ，或 整合入宿主基因組中潛伏起來 ，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。 Circular form Linear form 3′GCCCCGCCGCTGGAGC5′ 5′CGGGGCGGCGACCTCG3′ Cleavage (during packaging) Ligation (after infection) GGGCGGGCGACCTCG3′ GC5′ 5′CG 3′GCCCCGCCGCTGGA 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 占 λ噬菌體 DNA 40－ 50% ，裂解生長所必須 右臂 約為 810kb ，從 PR 啟動(dòng)子到右側(cè) cos 位點(diǎn)。根據(jù)執(zhí)行功能可將基因組分為三個(gè)區(qū)。 可被 ga1 基因或 bio 基因替換，不影響 λ 噬菌體裂解生長 。 λ噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細(xì)胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體 DNA上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為 溶原狀態(tài) 。 ① lacZ 基因 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ② cⅠ 基因 cⅠ 編碼的 λ抑制子 與操縱區(qū) OR1 和 OR2發(fā)生親和作用結(jié)合后，激活 PRM啟動(dòng) cⅠ 表達(dá) λ抑制子，結(jié)合 Cro及下游裂解蛋白基因的表達(dá)，抑制裂解生長 溶原 裂解 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering