【正文】 在 λ噬菌體線性雙鏈 DNA分子的兩端，各有一條由 12個(gè)核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ)的 5′單鏈突出序列，即通常所說(shuō)的 粘性末端 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 T載體與 TA克隆方法 TA克隆方法（ Original TA Cloning Kit）即利用 Taq聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能，在每條 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的 3`端自動(dòng)添加一個(gè) 3`A突出端。因此，在應(yīng)用 pUC8質(zhì)粒為載體的重組實(shí)驗(yàn)中，可用 Xgal顯色的組織化學(xué)方法一步實(shí)現(xiàn)對(duì)重組體轉(zhuǎn)化子克隆的鑒定。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pUC質(zhì)粒載體 pUC載體是在 pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個(gè)在其 5′端帶有一段多克隆位點(diǎn)的 lacZ′基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測(cè)特性的新型質(zhì)粒載體系列。它分為 表達(dá)型質(zhì)粒載體 和 表達(dá)型噬菌體載體 兩種不同的類型。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 插入失活型的質(zhì)粒載體 選用插入失活型質(zhì)粒，將外源 DNA片段插入在會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因（如 tetr、 ampr、 cmlr等）失活的位點(diǎn)，就有可能通過(guò)抗菌素抗性的篩選，大幅度地提高獲得陽(yáng)性克隆的幾率。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 適合于克隆含量過(guò)高對(duì)寄主代謝有害的 DNA。 2 質(zhì)粒 DNA的分離純化 實(shí)驗(yàn)室一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒 DNA： 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒 DNA純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染 堿溶法 質(zhì)粒 DNA純度底、快速、操作簡(jiǎn)便 沸水浴法 質(zhì)粒 DNA純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間 質(zhì)粒 DNA的分離純化 氯化銫密度梯度離心法： 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加 CsCl和溴乙錠 超速離心過(guò)夜 在紫外燈下吸取 cccDNA 稀釋沉淀 cccDNA proteins ocDNA LDNA cccDNA RNAs 質(zhì)粒 DNA的分離純化 堿溶法： 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加 NaOH和 SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染 色體 DNA及大部分蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚 氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì) 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 DNA 用無(wú) DNase的 RNase去除殘余的 RNA cccDNA LDNA ocDNA DDNA TDNA 質(zhì)粒 DNA的分離純化 沸水浴法： 用含有 EDTA和 Triton X100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴 40秒鐘 離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒 DNA 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型 天然質(zhì)粒用作隆載體的局限性 天然質(zhì)粒 ： 一般是指那些沒(méi)有經(jīng)過(guò)以基因克隆為目標(biāo)的體外修飾改造的質(zhì)粒。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ② 插入失活 (insertional inactivation) 外源 DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為 插入失活 (insertional inactivation)。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷（ Xgal） 可作為 lac 操縱子的底物，但不能作為誘導(dǎo)物。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 在 lacZ′編碼區(qū)上游插入一小段 DNA 片段（如 51 個(gè)堿基對(duì)的多克隆位點(diǎn)），不影響 β半乳糖苷酶的功能內(nèi)互補(bǔ)。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 乳糖操縱子（ lac operon） 大腸桿菌的乳糖 lac 操縱子中的 lacZ 基因編碼 β半乳糖苷酶（ βgalactosidase），如果 lacZ 基因發(fā)生突變，則不能合成有活性的 β半乳糖苷酶。 supE 基因在 UAG 密碼子上編譯谷氨酰氨。在細(xì)胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì)腔，保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響。在乙酰輔酶 A 存在的條件下，該蛋白催化氯霉素形成氯霉素羥乙酰氧基衍生物，使之不能與核糖體結(jié)合。 pBR322 質(zhì)粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 選擇標(biāo)記 氨芐青霉素抗性基因 （ Ampicillin resistance gene, ampr） 四環(huán)素抗性基因 （ Tetracycline resistance gene, tetr） 氯霉素抗性基因 （ chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat） 卡那霉素和新霉素抗性基因 （ kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor） 琥珀突變抑制基因 supF 蔗糖致死基因 SacB 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ① 氨芐青霉素抗性基因 （ Ampicillin resistance gene, ampr） 氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記，絕大多數(shù)在大腸桿菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 R質(zhì)粒 也稱抗藥性因子。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。所以這些質(zhì)粒的拷貝數(shù)不能通過(guò)諸如 氯霉素 等蛋白質(zhì)合成抑制劑來(lái)增加拷貝數(shù) 1） 松弛復(fù)制型 多拷貝質(zhì)粒（ pMB1或 ColE1等）的復(fù)制不受宿主菌蛋白合成的影響的影響；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)合成不能進(jìn)行時(shí)，復(fù)制依然進(jìn)行 2) 嚴(yán)緊型復(fù)制 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 How many copies can be replicated ? 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Negative control positive control answers Repressor model: cop factor Antisense RNA model: RNAⅠ RNAⅡ Rep protein pMBl/colEl復(fù)制子 pSC101復(fù)制子 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 RNAⅠ 和 RNAⅡ 復(fù)制 copies的調(diào)節(jié) RNAⅡ 由 ori上游的－ 550到下游的＋ 200轉(zhuǎn)錄出約為 750nt的 RNA RNAⅠ 由 RNAⅡ 基因反義鏈編碼的 108nt的 RNA，與 RNAⅡ 互補(bǔ) ① 控制復(fù)制引物與模板的結(jié)合 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 RNAⅡ 在 RNaseH的作用下加工成 550nt的成熟引物，起始復(fù)制 RNAⅡ 5′端產(chǎn)生一個(gè)富含 G的環(huán)與 ori上游 20bp處的富含 C區(qū)互補(bǔ) 0 555 0 RNA2 RnaseH OH RNA2 DNA / RNA primer for DNA replication +150 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 此處復(fù)雜的 RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的正確折疊是復(fù)制起始的關(guān)鍵 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 RNAⅠ 108 bp RNase H 不能識(shí)別 RNA2, 不能形成 primer 的 3’OH 555 445 0 RNAⅡ RNAⅠ RNAⅡ 108 bp . RNA RNAⅠ 與 RNAⅡ 互補(bǔ)后，不能起動(dòng)復(fù)制 質(zhì)粒復(fù)制依賴于宿主酶活性，一旦開(kāi)始復(fù)制則不能自主控制自制速度和進(jìn)程，故必須在復(fù)制啟動(dòng)前或啟動(dòng)時(shí)由RNAⅠ 來(lái)控制 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 RNA1 0 When RNA2 200360Nt Rom gene expression, RNAⅠ / RNAⅡ . repression RNAⅠ / RNAⅡ 不能形成 primer的 3’OH 促進(jìn) 限 制 63 aa ROP (Rom protein) RNAⅡ 只能轉(zhuǎn)錄到 100220 base, 不能到達(dá)“ 0”原點(diǎn) 不能形成 primer 的 3’OH 0 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 RNAⅠ 和 RNAⅡ 之間“親吻復(fù)合物”的放大。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 基因工程中常用的主要載體 質(zhì)粒 (Plasmid)，主要指人工構(gòu)建的質(zhì)粒 噬菌體載體 柯斯質(zhì)粒 (cosmid) 單鏈 DNA噬菌體 M13 動(dòng)物病毒 人工染色體 (artificial chromosome) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 載體的功能及特征 載體的功能 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 載體應(yīng)具備的條件 具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標(biāo)記 具有較 高的外源 DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322 4363 bp 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 克隆載體 （ cloning vector） 對(duì)目的基因克隆，建立 DNA文庫(kù)和 cDNA文庫(kù)，其上有復(fù)制子即可 按功能分類 表達(dá)載體 （ expression vector） 使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)，既有復(fù)制子，又有強(qiáng)啟動(dòng)子 穿梭載體 （ shuttle vector） 可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。第三章 分子克隆載體（ Molecular cloning vectors） 周毅峰 2022春 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 在基因工程中，通常是把外源 DNA片斷利用運(yùn)載工具送入生物細(xì)胞。 經(jīng)過(guò)人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連接，導(dǎo)入受體細(xì)胞，還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)，使外源基因在新細(xì)胞中復(fù)制以致功能的表達(dá)。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 1 質(zhì)粒的基本特性 2 質(zhì)粒 DNA的分離純化 4 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 質(zhì)粒 DNA的構(gòu)型 兩條多核苷酸鏈均保持著完整的環(huán)形結(jié)構(gòu)，稱為共價(jià)閉合環(huán)形 DNA（ cccDN