【正文】 啟動(dòng)子 ④ lacZ’基因 約 10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于 lacZ’基因的 5’端。不能通過接合轉(zhuǎn)移。 獲得載體的寄主細(xì)胞 ? 在 Amp或 Tet其中之一中死亡。 元件來源 4363bp 氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。 v）四環(huán)素（ Tetracycline， Tet） b）細(xì)菌抗性原理： Tetr 編碼特異性蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)菌的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，組止四環(huán)素通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。 iii）卡那霉素（ kanamycin， Kan） b）細(xì)菌抗性原理： Kanr 編碼的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，對(duì)卡那霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體結(jié)合作用。 a）抑菌原理： 通過與 50S核糖體亞基結(jié)合，干擾細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。 理想載體條件 A、 較小的分子和較高的拷貝數(shù) B、 多個(gè)單一的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) C、 兩種以上的選擇標(biāo)記 D、 易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá) ： 氨芐青霉素抗性（ Ampr） 卡那霉素抗性 （ Kanr） 四環(huán)素抗性 （ Tetr） 鏈霉素抗性 （ Strr） 氯霉素抗性 （ Cmlr） 絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標(biāo)記： i）氨芐青霉素（ Ampicillin， Amp） ,青霉素的衍生物。 （ 2）篩選標(biāo)記不理想 ColE1質(zhì)粒的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素 E1（ colicin E1）。 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性 革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾? 接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞，如 F、 Col、 R質(zhì)粒等 非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用如 Col、 R的其它成員 某些非接合型質(zhì)粒（ ColE1） 在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生 DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過程由 bom 和 mob 基因決定。第三章 用于基因克隆的載體 質(zhì)粒（ plasmid） 噬菌體或病毒 DNA 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 與噬菌粒 人造染色體載體 載體的功能及特征 載體的功能及特征 載體的功能 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件 載體應(yīng)具備的條件 具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標(biāo)記 具有較 高的外源 DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn) 具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn) 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒的基本特征 A: 質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子； B: 質(zhì)粒常見于原核細(xì)菌和真菌中； C: 絕大多數(shù)的質(zhì)粒是 DNA型的； D: 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即 cccDNA； E: 質(zhì)粒 DNA的分子量范圍： 1 300 kb。 SC OC L 質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 質(zhì)粒的自主復(fù)制性 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的 DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒 DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型： 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 1 3 拷貝 stringent plasmid 松弛型質(zhì)粒 10 60 拷貝 stringent plasmid 任何兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群 以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE pMB1 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 pSC10 F、 RP4 擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 質(zhì)粒的不相容性 質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制 兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì) 兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，復(fù)制時(shí)受各自拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，經(jīng)過若干復(fù)制和細(xì)胞分裂周期后仍能共處同一細(xì)胞內(nèi)。 但只有一個(gè) EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn)， Tetr 作為篩選標(biāo)志。 唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I 正好位于這個(gè)基因的內(nèi)部。 ii）氯霉素（ chloramphenicol， Cml） b）細(xì)菌抗性原理： Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙?；Щ睢⑺兰?xì)菌。 b）細(xì)菌抗性原理： Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)鏈霉素進(jìn)行修飾，阻斷其與核糖體 30S亞基結(jié)合作用。 質(zhì)粒的分類 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù) 10003000 擴(kuò)增基因 低拷貝質(zhì)粒 來自 pSC101 拷貝數(shù)小于 10 表達(dá)某些毒性基因 溫敏質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì) 測(cè)序質(zhì)粒 含有測(cè)序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭 polylinker 整合質(zhì)粒 裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn) 便于外源基因的整合 穿梭質(zhì)粒 裝有針對(duì)兩種不同受體的復(fù)制子 便于基因克隆 表達(dá)質(zhì)粒 裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件 探針質(zhì)粒 裝有報(bào)告基因 便于啟動(dòng)子等元件的克隆篩選 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體 松弛型復(fù)制 pBR322： 氯霉素可擴(kuò)增 拷貝數(shù) 50 100 / cell 用于基因克隆 pBR322 4363 bp Origin of Replication ROP ROI Sal I BamH I Tc r Pvu I Pst I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Ap r pBR322 由 F. Bolivar和 . Rodriguez人工構(gòu)建 ① 復(fù)制起點(diǎn) ori： pMB1系列（來源于 ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) ② Ampr基因： pSP2124質(zhì)粒的 Ampr基因 ③ Tetr基因： pSC101的 Tetr 基因。 （ 2）長(zhǎng)度 （ 3）選擇標(biāo)記 （ 4）克隆位點(diǎn) ① 雙抗菌素抗性