《基因克隆原核表達(dá)》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 Gene Cloning ?概述 ?克隆載體 ?受體細(xì)胞 ?體外重組的策略 ?基因克隆工作流程 一、概 述 1973年 Cohen完成第一個(gè)基因工程實(shí)驗(yàn) 經(jīng) 體外重組 獲得雜合 DNA 雜合子轉(zhuǎn)化入大腸桿菌 ?所需元件： 限制性內(nèi)切酶 連接酶 載體 受體細(xì)胞 基因克隆（分子克隆 molecullar cloning） 通過(guò)體外重組技術(shù) ,將一段目的 DNA經(jīng)切割、連接插入適當(dāng) 載體 ，并導(dǎo)入 受體細(xì)胞 ，擴(kuò)增形成大量子代分子的過(guò)程。 要求：易于接納外源 DNA 無(wú)特異的內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶 載體復(fù)制、擴(kuò)增不受阻 與載體有互補(bǔ)性 四、體外重組的策略 粘末端連接 1）全同源粘末端連接 ? 最方便簡(jiǎn)單 ? 高背景 載體自身環(huán)化 ? 雙向插入 2）定向克隆： 使外源基因定向插入到載體中的克隆策略 ? 粘 粘連接：最有效、最快捷 ? 粘 平連接：適用于外源基因僅與載體有一個(gè)相同酶切位點(diǎn)，可將另一末端補(bǔ)平 平末端連接： ? 酶切點(diǎn)為平末端或任何兩個(gè)末端補(bǔ)平的 DNA ? 效率低，酶用量大 人工接頭連接 人工接頭：人工合成含有酶切位點(diǎn)的寡核苷酸片段 TA克隆 ? Tvector兩條鏈的 5’端含有一個(gè)游離的 T ? PCR過(guò)程中，增加延伸時(shí)間， Taq酶可在產(chǎn)物的 3’端多加一個(gè) A 五、基因克隆的工作流程 （一）目的基因的獲得 直接分離 構(gòu)建 cDNA文庫(kù) PCR 人工合成 差異顯示 直接分離 DNA— 適用于克隆原核生物的基因組文庫(kù) 構(gòu)建基因組文庫(kù)，篩選目的基因 ? 基因組文庫(kù) (gene library)：將某種生物的基因組 DNA切割成一定大小的片段，并與合適的載體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，進(jìn)行克隆。 ?cDNA文庫(kù)僅包含正在表達(dá)的基因 ?不同物種、不同組織的 cDNA文庫(kù)不相同 ?基因總量少，易篩選 PCR擴(kuò)增目的基因片段 ? 適用于克隆序列清楚的基因 ? 以基因組 DNA為模板，直接進(jìn)行 PCR擴(kuò)
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