【正文】 量大（ 45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍 能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞 中自主復(fù)制 重組操作簡便，篩選容易 不能體內(nèi)包裝，不裂解 受體細(xì)胞 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 柯斯克隆 應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組 DNA技術(shù)，叫做 “柯斯克隆”（ cosmid cloning） 線性 λ噬菌體 DNΑ分子末端 cos位點，在 λ噬菌體的正常生命周期中，會產(chǎn)生由數(shù)百個 λDNA拷貝組成的多連體分子。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 3 單鏈 DNA噬菌體載體 (M13) M13噬菌體載體是一種含單鍵（ +） DNA（ ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為 。而且重組分子越大，混濁 斑的混濁度亦越大 但 M13DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有 kb 第 3節(jié) 植物基因工程載體 Ti 質(zhì)粒 YEP培養(yǎng)基上的根瘤農(nóng)桿菌 LB培養(yǎng)基上的大腸桿菌 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌 農(nóng)桿根瘤菌 （ ）感染所致，其致瘤特性是由該菌細(xì)胞內(nèi)的野生 型質(zhì)粒 Ti（ Tumorinducing）介導(dǎo)的。 除去 Ti 質(zhì)粒上的其它非必需序列 ， 最大限度地縮短載體的長度； 共整合轉(zhuǎn)化程序 大腸桿菌質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記多克隆位點重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌農(nóng)桿菌細(xì)菌接合 T D N A 區(qū)同源整合農(nóng)桿菌感染植物根部細(xì)胞 T D N A 區(qū)整合在植物細(xì)胞基因組上二元整合轉(zhuǎn)化程序 LB RBT DN A外源基因植物細(xì)胞篩選標(biāo)記 Km r大腸桿菌 農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒大腸桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記農(nóng)桿菌 ori大腸桿菌 ori將外源基因克隆在大腸桿菌 農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的 TDNA區(qū)內(nèi)； 重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌株 ， 該菌株攜帶只含 vir區(qū)不含 TDNA區(qū)的 Ti輔助質(zhì)粒； 以上述重組農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 yeast artificial chromosome YAC 酵母人工染色體載體 目前常用的人造染色體載體包括： 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 bacterial artificial chromosome BAC 細(xì)菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 The essential elements for chromosome maintenance and transmission are the following three regions: (1) the “replication origin,” from which the duplication of DNA begins, (2) the “centromere,” which functions in proper chromosome segregation during cell division, and (3) the “telomere,” which protects the ends of linear chromosomes A human artificial chromosome (HAC) is a minichromosome that is constructed artificially in human cells 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 P1 artificial chromosomes,PAC, P1 人工染色體 transformationpetent artificial chromosome, TAC, 可轉(zhuǎn)化人工染色體 bacterial artificial chromosome , BIBAC, 雙元細(xì)菌人工染色體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Cloning vector Size of insert Standard high copy number plasmid vectors 010 kb Bacteriophage l insertion vectors 010 kb Bacteriophage l replacement vectors 923 kb Cosmid vectors 3044 kb Bacteriophage P1 70100 kb PAC (P1 artificial chromosome) vectors 130150 kb BAC (bacterial artificial chromosome) vectors up to 300 kb YAC (yeast artificial chromosome) vectors Mb 各類典型基因克隆載體的容量 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 酵母人工染色體載體 yeast artificial chromosome, YAC 1983年，美國的 DanaFarber癌癥研究所和哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的教授首次在 Nature上發(fā)表文章，報道了構(gòu)建 YAC（ Yeast Artificial Chromosome）庫的過程。 將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn) 定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。 vir基因產(chǎn)物將 Ti質(zhì)粒上的 TDNA單鏈切下，而根瘤菌染色體上的操縱子表達(dá)產(chǎn)物則與單鏈 TDNA結(jié)合形成復(fù)合物，后者轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。 2700個外殼蛋白分子 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13噬菌體載體體形圖 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13單鏈 DNA噬菌體的生命周期 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Phage M13 replication in the host cell: + RNA pol DNA polIII 177。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λDNA分子具有 兩個 cos位點 ， Ter體系發(fā)生作用的條件 兩個 cos位點之間的距離 38～ 54kb 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 采用柯斯質(zhì)粒作載體的 困難??！ ① 載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的 1/10左右，常出現(xiàn)載體與載體連接 用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接 ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子 選出 30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，每個載體只可能插入一個外源片段 如果二個片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ③ 細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費時間。 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） 1978年， J． Coffins及 B． Hohn等人發(fā)展出柯斯質(zhì)粒載體。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 重組分子 尾部基因 琥珀突變型 Sup細(xì)菌 尾部基因 提取物 頭部基因 提取物 頭部基因 琥珀突變型 完整的噬菌體 體外互補作用研究 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λ噬菌體 DNA的包裝限制問題 上限不得超過其正常野生型 DNA總量的 5％左右 λ噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納 DNA的能力是有一定限度的。 轉(zhuǎn)染效率： 每微克 λDNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目 λDNA的轉(zhuǎn)染作用，是一種低效的過程。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λNM781感染寫宿主后能在乳糖麥康基氏（ Macconkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生 紅色的噬菌斑 重組 λNM781感染寫宿主后能在乳糖麥康基氏（ Macconkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生 無色的噬菌斑 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 對重組體的 λDN A分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的 λ重組噬菌體。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 插入型載體 只能承受較小分子量（一般在 10kb左右）的外源DNA片段的插入，應(yīng)用于 cDNA及小片段 DNA的克隆。 β半乳糖苷酶失活的（ inactlvatlon of βgalactosidase） 免疫功能失活的（ inacti vatiort of immunityfunction） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 免疫功能失活的（ inacti vatiort of immunityfunction） 基因組中有一段免疫區(qū)（ cⅠ ），有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切割位點。 因此 ， 縮短野生型 λDNA的長度 ， 可以提高裝載量 。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ④ Spi 篩選 野生型 λ 噬菌體在帶有 P2 原噬菌體的溶源性 中 的生長會受到限制的表型，稱作 Spi+ ，即對 P2 噬菌體的干擾敏感（ sensitive to P2 interference）。 DNA重組技術(shù)一般需要 λ噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài) 人們可以根據(jù)需要改變 λDNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于 溶菌狀態(tài) ，或處于溶菌狀態(tài) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體的選擇性標(biāo)記 lacZ 基因也可用于 λ 噬菌體載體，通過插入或替換載體中的 β半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/Xgal 平板上可通過噬菌斑的顏色，篩選重組噬菌體。 Right arm Left arm 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體的可取代區(qū)（中間區(qū)或非必需區(qū)） J 基因與 Cro 基因之間的 DNA ， 占 λ噬菌體 DNA 的 1/3 ，主要包含控制 λ噬菌體進(jìn)入溶源狀態(tài)的調(diào)節(jié)基因和功能基因。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 病毒的上述特性使得它們的 DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為： 高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴增 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 大腸桿菌的 λ噬菌體 DNA衍生的載體 黏性質(zhì)粒 載體：含有 λ 噬菌體 DNA的某些位點并被包裝而獲得的載體 M13：小分子的絲狀單鏈?zhǔn)删w 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 1 λ噬菌體 l 噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu) l 噬菌體是 大腸桿菌的溫和型噬菌體 l 噬菌體 由外殼包裝蛋白和 lDNA組成 lDNA全長 48502個核苷酸 lDNA上 至少有 61個基因 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 l 噬菌體基因組結(jié)構(gòu) 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 The phage l cos ends： cos位點（ cohesiveend site，粘性末端位點 ）