【正文】 合酶編碼基因和整合特異性位點序列 ， 克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因進入受體細胞后 ， 能準確整合在受體細胞染色體 DNA的特定位點 。 含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu) 、 相應(yīng)的選擇標記基因 ， 能在兩種不同種屬的受體細胞中復(fù)制并被檢測 。 探針質(zhì)粒： 用于 篩選表達調(diào)控元件 ， 如啟動子 、 終止子 。 噬菌體吸附在 噬菌體釋放、菌體裂解 T4噬菌體 The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle. The electron micrograph of the single linear DNA molecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp)。 ?DNA兩端各有 12個核苷酸組成的 5’突出粘性末端 (cohensiveend)， 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ ?DNA 二者的核苷酸 序列互補， 進入宿主細胞后 ， 粘性末端連接成環(huán)狀 DNA分子 ， 此末端稱為 cos位點 (cohensiveend site)。 溶源周期： 整合到細菌染色體的 DNA隨細菌染色體復(fù)制而復(fù)制 。 整合由 ?DNA上 cI和 int基因的產(chǎn)物激活 ，這兩個基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細胞本身的性質(zhì) 。 溶菌 感染早期：雙鏈進行 ?型復(fù)制。 縮短野生型 ?DNA長度 ， 可提高裝載量 。 取代型載體的 2個 MCS區(qū)以 反向重復(fù) 形式位于?DNA非必需區(qū)的兩端 ， 通過酶切 ， 可將中間的非必需區(qū)切下來 ， 與用相同酶酶切的外源 DNA置換 。 限制酶酶切； 非必需區(qū)： 必需區(qū)： 加裝選擇標記 野 生型 ?DNA上缺少合適的選擇標記。 當外源基因插入 lacZ中 ， 基因滅活 ， 不能生成藍色化合物 。 將野生型 ?DNA上 D和 E兩個頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG。 這是基于 安全性 而設(shè)計的 。 M13單鏈噬菌體 DNA 生物結(jié)構(gòu)： 外型呈絲狀； 由外殼包裝蛋白和單股正鏈 DNA組成； 基因組為 單鏈線性 DNA，長 kb； DNA上至少有 10個基因，均為增殖所必需。 M13 DNA載體的構(gòu)建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13 RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13 mp系列載體 lacZ’ polylinker IG IG區(qū)內(nèi)只有 1個 Bsu I 切點 M13mp18的多克隆位點與 pUC18相同 M13 DNA載體的特點： 克隆的 DNA以單鏈形式輸出 ， 便于測序； M13重組子篩選簡便； 最大缺陷是裝載量小，僅 kb。 考斯質(zhì)粒和噬菌粒的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體 DNA的裝載量。 由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒 不攜帶包裝蛋白基因 ， 因此重組 DNA分子在細胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒 。 ? 噬菌粒（ phagemid） 是一類人工構(gòu)建的含 單鏈噬菌體 包裝序列 、 復(fù)制子和 質(zhì)粒 復(fù)制子 、 克隆位點 、標記基因的特殊類型載體 。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 輔助噬菌體： 自身 ori突變 、 復(fù)制效率低 ， 但感染宿主細胞后 ， 能表達出外殼蛋白和復(fù)制蛋白 ， 幫助噬菌粒載體復(fù)制 ， 如 M13K07。 當大片段外源 DNA克隆在人工染色體載體上 ， 便形成重組人工染色體 ， 它能像天然染色體那樣 ， 在受體細胞中穩(wěn)定復(fù)制并遺傳 。 Hind III和 BamH I：克隆位點； BAC的組成： BAC主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster） ； 構(gòu)建動植物基因文庫（ gene library or gene bank）。 。 按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建； 特點： 在酵母細胞中擴增。 裝載量大，為 300 kb； BAC的特點： 單拷貝復(fù)制； 可以像提取質(zhì)粒一樣直接提取克隆的 DNA。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 人工染色體載體 人類 、 動物 、 植物的全基因組序列分析需克隆數(shù)百甚至上千 kb DNA片段 ， 此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠不能滿足需要 。 通過克隆雙鏈 DNA，能獲得同等長度的單一單鏈DNA； 重要的噬菌粒載體 pUC118/119 = pUC18/19的 ori、 Ampr、 lacZ’、 MCS + M13IG、 ori 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Ampr M13IG pUC118/119 pUC118/119： 1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式 在宿主細胞沒有感染上 M13輔助噬菌體時 ， 受 pUC本身的復(fù)制起點控制 ， 每個細胞能達 500個拷貝 。 cos site carrying plasmid； 考斯質(zhì)粒載體的特點： 能像 ?DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染 ； 裝載量大（ 45 kb） ； 能像質(zhì)粒那樣在 ； 制備與質(zhì)粒相同， 重組操作簡便，篩選容易 ； 與 ?DNA不同：不能體內(nèi)包裝，不裂解 。 在包裝上限固定的條件下 ， 大幅度縮短噬菌體 DNA的長度 ， 就能同步增加載體的裝載能力 。 動植物病毒 DNA 單鏈 DNA病毒 雙鏈 DNA病毒 單鏈 RNA病毒 雙鏈 RNA病毒 按基因組結(jié)構(gòu)，將動植物病毒分成四類： 動植物病毒克隆載體 雙鏈 DNA病毒：如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 單鏈 DNA病毒：如番茄金黃花葉病毒 (TGMV) RNA病毒：如雀麥草花葉病毒 (TMV) 用于構(gòu)建克隆載體的植物病毒： RNA病毒在自我復(fù)制時大多存在相應(yīng)的 DNA中間體 ，可作為載體進行常規(guī)的 DNA重組。 組裝成新的噬菌體 M13，擠出寄主細胞 M13通過雄性細菌的 F性須注入其 +DNA +DNA合成 DNA，形成雙鏈 RF DNA 復(fù)制 +DNA，轉(zhuǎn)錄 mRNA、翻譯形成噬菌體蛋白 +DNA +DNA 注入 +DNA 指導(dǎo)合成 M13外殼蛋白 轉(zhuǎn)錄 翻譯 mRNA 復(fù)制 +DNA 200個 RF DNA DNA （每個細胞可釋放約 1000個 M13顆粒） 組裝成子代 M13