【正文】 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用 ，如 ColE1質(zhì)粒 。 質(zhì)粒與宿主細胞的關(guān)系： 質(zhì)粒對宿主的生存不是必需的 ， 只是 “ 友好 ”的 “ 借居 ” 宿主細胞中 。 The genomic DNA of : a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell plasmid DNA Genomic DNA 4） 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價 、 閉合 、 環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)(covalently closed circular DNA, cccDNA)， 以超螺旋形式存在 。 兩種含 相似 復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 在復制時受同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾 ， 致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同 ， 其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢 。 按分子量大?。? 15kb，多為接合型質(zhì)粒； 15kb，多為非接合型質(zhì)粒。 實驗室用質(zhì)粒多以少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建： pSC101： ，拷貝數(shù) 5，四環(huán)素抗性基因 Tetr。 克隆的外源基因可不用更換載體、直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體菌中復制并遺傳。 溶菌周期： 吸附 LamB受體 注入 復制 包裝 裂解 感染細菌后 ， 立即在菌體內(nèi)復制和合成蛋白質(zhì)外殼 ， 重新組裝成噬菌體顆粒 ， 并導致細菌細胞裂解 ， 釋放出大量子代噬菌體 。 體外包裝 插入位點 載體長度： 37 kb 體外包裝 插入片段 插入片段： 014 kb 插入型載體 (insertion vectors)： 取代型載體 (substitution vectors)： 載體長度： 26 kb 體外包裝 插入片段 插入片段： 1125 kb 含某一限制酶的兩個切點 ， 兩切點間的片段(可置換區(qū) )可被外源 DNA替代 ， 如 ?MBL系列 。 重組 ?DNA的體外包裝 用于體外包裝的蛋白可直接從感染 ?噬菌體的 ， 已商品化 ， 通常為互補的兩部分：一部分 缺少 E組份 ， 另一部分 缺少 D組份 。 將 噬菌體 DNA包裝有關(guān)序列 與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 既能縮短載體長度 、 提高裝載量 ， 又能保證重組 DNA在體外仍被包裝成有感染性的顆粒 。 在細菌細胞中擴增； CMR：氯霉素抗性基因； parA、 parB：控制拷貝數(shù)； oriS、 repE：復制起點，控制質(zhì)粒單向復制； oriS、 repE、 parA、 parB來自性因子； Not I：用于切下外源 DNA。 細菌人工染色體 酵母人工染色體 將 細菌 接合因子或 酵母 染色體的復制區(qū) 、分配區(qū) 、 穩(wěn)定區(qū)與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 即構(gòu)成 人工染色體載體 (artificial chromosome)。 常用的動物病毒載體 腺病毒 腺相關(guān)病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒 慢病毒 改造的猴腎病毒 SV40 痘苗病毒 皰疹病毒 昆蟲桿狀病毒 應用動物病毒弱毒或無毒株 : （四）考斯質(zhì)粒與噬菌粒 ?DNA和 M13DNA載體的最大裝載量分別為 25kb和 ， 但很多情況下 ， 往往需要克隆更大的外源 DNA片段 。 基因工程實驗中使用的受體是具有 琥珀型突變體校正功能 的菌株 。 ?DNA載體的構(gòu)建 野生型 ?噬菌體 能包裝原 ?DNA長度的75105%（ 3751kb） ， 本身長度為 ， 只有當插入的外源 DNA片段 ≤ ， 才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 噬菌體或病毒 DNA能被開發(fā)為基因工程載體的原因： 高效感染性 自主復制繁殖性 ?噬菌體 DNA 生物結(jié)構(gòu)： ?DNA為雙鏈線性 DNA，長 kb； ?噬菌體是 ； ?噬菌體由外殼包裝蛋白和 ?DNA組成； ?噬菌體能包裝原 ?DNA長度的75105%，約 3751kb； cos位點 對包裝至關(guān)重要。 如： pUC18/19： r BamH I pUC18 2,686 bp Amp lacZ39。 氨芐青霉素抗性（ ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（ kanamycin, Kanr） 四環(huán)素抗性（ tetracycline, Tetr） 鏈霉素抗性（ streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（ chloromycetin, Chlr） 常用的選擇標記： 2）根據(jù)克隆子藍白顏色進行篩選的 lacZ’基因。 R質(zhì)粒： 抗藥性質(zhì)粒， 帶有一種或多種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀。 2） 松弛型質(zhì)粒 (relaxed plasmid)： 如： pMB ColE1。 載體 (vector)： 載體的功能： 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。 嚴緊型質(zhì)粒 根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為： 松弛型質(zhì)粒 13拷貝 /cell，復制受細胞核控制，伴隨染色體 DNA復制而復制。 野生型質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因 ， 使寄主產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀 。 2） 滅活某些編碼基因 滅活促進質(zhì)粒在細菌種間轉(zhuǎn)移的 mob基因 ，杜絕重組質(zhì)粒擴散污染環(huán)境 ， 保證 DNA重組實驗的 安全性 。 溫度 37℃ 時，拷貝數(shù)很低； 溫度 40℃ 時，拷貝數(shù)很快增至 1000個以上。 噬菌體吸附在 噬菌體釋放、菌體裂解 T4噬菌體 The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle. The electron micrograph of the single linear DNA molecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp)。 溶菌 感染早期：雙鏈進行 ?型復制。 當外源基因插入 lacZ中 ， 基因滅活 ， 不能生成藍色化合物 。 M13 DNA載體的構(gòu)建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13 RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13 mp系列載體 lacZ’ polylinker IG IG區(qū)內(nèi)只有 1個 Bsu I 切點 M13mp18的多克隆位點與