【正文】 聚合酶 23 大腸桿菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 1． DNA 聚合酶 Ⅰ 的活性 ① 5‘3’ DNA 聚合酶活性。 ⑥ 應用于 Sanger 雙脫氧鏈末端終止法的 DNA 測序。 34 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶的功能是去除 或 5＇ 未端的磷酸基 ， 反應可表示為： 堿性磷酸酶 5‘p DNA或 5’p RNA 5’－ HO DNA或 5’－ OH RNA 堿性磷酸酶可用于： 1)去除 片段 5‘磷酸 ， 以防止在重組中的自身環(huán)化 ， 以提高重組效率 。廣泛用來去除 DNA 樣品中的 RNA 。 嚴緊型質粒 : 復制要求同時表達一個由質粒編碼的蛋白質。 pBR322 質粒除了帶有氨芐青霉素抗性基因外，還帶有四環(huán)素抗性基因。 ? m 二、 噬菌體 (Bacterophage)載體 64 噬菌體的形態(tài) 65 ?噬菌體 275,000, Scanning electron microscopy 66 λ噬菌體特性： ?含有線性雙鏈 DNA分子，其長度為 48502 bp，兩端各有 12個核苷酸組成的 5’端凸出的互補粘性末端 (cohesive end, cos)，當 λDNA進入宿主細胞后，互補粘性末端連接成為環(huán)狀 DNA分子。 為此 ， 須從現(xiàn)有生物群體中 ， 根據(jù)需要分離出可用于克隆的此類基因 。OH 端，合成 DNA ，這個步驟稱為 延伸 （ extension）。以酵母菌、細菌、質粒和 M13 噬菌體噬菌斑的 DNA 作模板時，要達到這么多拷貝數(shù)分別需要 10ng， 1ng，1pg 和 1% 噬菌斑。 外切活性的高溫 DNA 聚合酶的高持續(xù)活性和校正功能結合起來，可以達到很好的效果。 外切活性的高溫 DNA 聚合酶時，有時會擴增不出產物。 104 第五節(jié) . 目的基因的獲得 Making a genomic DNA libraries with plasmid vectors 105 3種通用的鑒定方法： ?用標記的 DNA探針做 DNA雜交 ?用抗體對蛋白質進行免疫雜交 ?對蛋白質的活性進行鑒定 鑒定文庫中帶有目的序列的克隆的方法 106 用標記的 DNA探針做 DNA雜交 3’ 5’ 5’ 3’ 變性、轉膜 3’ 5’ 5’ 3’ 加入標記探針、雜交 3’ 5’ 3’ 5’ 探針 * * * 探針 * * * 放射自顯影 在培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落 菌落印在膜上 菌落蛋白裸露出來 一抗與裸露的蛋白結合 二抗與一抗結合 顯色 找出陽性克隆 傳膜 裂解 加一抗 洗去一抗，加二抗 洗去游離的二抗，加顯色劑 通過免疫反應進行基因文庫的 篩選 107 組建一個 cDNA文庫的步驟： 1)分離表達目的基因的組織或細胞 2)從組織或細胞中制備總體 RNA和 mRNA 3） 第一條 cDNA鏈的合成 ， 第一條互補 DNA鏈的合成需要 RNA模板 ， cDNA合成引物 ， 逆轉錄酶 ， 4種脫氧核苷三磷酸以及相應的緩沖液 (Mg2+)等 。 116 （二）平頭末端連接 粘性末端轉化為平頭末端 末端添補法和末端消除法，Kienow片段常用于末端補平， S1和 Bal31等核酸酶常用于末端消除。 （一）重組 DNA向細菌細胞導入 122 感受態(tài)細胞 (petent cells)是指處于能攝取外界DNA分子的生理狀態(tài)的細胞 。 6. 粒子轟擊法 (particle bombardment) 金屬微粒 在外力作用下達到一定速度后 ， 可以進入 植物細胞 ，但又 不 引起細胞致命傷害 ， 仍能維持正常的生命活動 ?！?通過有目的地植入遺傳物質，將來可以培養(yǎng)出適合人類接受、不產生排異反應的移植器官 ”，沃爾夫說。 轉基因超級鼠 1982年，英國的 《 自然 》 雜志發(fā)表了一篇文章：有兩個美國實驗小組利用轉基因技術，將大鼠 生長激素重組基因導入到小鼠受精卵中 ,培育出具快速生長效應的“轉基因超級鼠”。 轉基因動物的應用前景 150 生物反應器是指利用轉基因活體動物的某種能夠高效表達外源蛋白的器官或組織來進行工業(yè)化生產活性功能蛋白的技術，這些蛋白一般是藥用蛋白或營養(yǎng)保健蛋白。 1996年 7月 5日，多莉降臨人世。 廣義的基因治療還應包括基因調控，如利用RNAi技術抑制基因表達。 ：多莉因早衰并患有肺炎，被迫實施了安樂死。 建立多種疾病的動物模型，研究發(fā)病機理及治療方法。 * 常結合 Northern印跡技術，檢測基因表達調控。沃爾夫等人在 《 歐洲分子生物學組織通訊 》 上發(fā)表論文說，他們在豬胚胎尚是單細胞階段時就利用沒有毒性的慢病毒作為載體，向其植入了一種名為 GFP的外來基因。 5. 脂質體介導法 脂質體 (liposome)是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜狀結構 ， 把用來轉染的 DNA分子包在其中 ， 通過脂質體與細胞接觸 ， 將外源 DNA分子導入受體細胞 。 121 轉化與轉化 把純化的 外源 DNA分子 導入細菌細胞的過程叫轉化 。 *原核生物的載體有：質粒， λ噬菌體等。 cDNA文庫和基因文庫的不同之處在于， cDNA文庫除去了 mRNA拼接過程中除去的內含子等成分，便于 DNA重組的使用。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣，在最后加入 DNA 聚合酶。539。如果 5% 用于擴增 1kb 的 DNA 片段，可得到 μg 的產物，足以用于常規(guī)分析。引物是 DNA 復制的先鋒，就象結晶過程中的晶核，引導 DNA 的合成。 （ 2)穩(wěn)定整合到染色體 DNA上復制。 且經氯霉素擴增后 ， 每個細胞中可累計1000－ 3000個拷貝 。青霉素可抑制細胞壁肽聚糖的合成，與有關的酶結合并抑制其活性，抑制轉肽反應。 通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區(qū)（整個遺傳單位定義為 復制子 ）。在 Mg 2+ 存在下，獨立作用于每條 DNA 鏈，且切割位點隨機。 用于將兩段乃至數(shù)段 DNA片段拼接起來的酶稱為連接酶 。 ② 抹平 DNA 3’凸端。 如 EcoRI來源于 RY13 BamHI來源于 16 H in d II Haemophilus(屬名 ) Influenzae(種名 ) d(株系 ) 羅馬數(shù)字 限制性內切酶命名舉例 17 類別 反應必須因子 專一性 活性 I型 S腺苷基蛋氨酸，ATP， Mg2+ 識別部位和切點不同， 無特定切割位點 內切 甲基化 II型 Mg2+ 切斷識別部位或其附近的特定部位 只有限制酶活性 III型 ATP， Mg2+ 識別部位和切點不同，但切斷特定部位 內切 甲基化 （三）限制性內切酶分類 18 19 （四） II 型限制性內切酶的特性 （ 1） II型限制酶的識別特異性 ? 回文識別序列 II型限制酶的識別序列大多是具有 雙重對稱結構性結構 ,或稱 回文序列 (Palindromic Sequence) 20 （ 2） 識別特定的核苷酸序列 ， 其長度一般為 4－ 8個核苷酸且呈二重對稱 。 24 2． DNA 聚合酶 Ⅰ 的用途 ① 利用 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5‘3’ 外切核酸酶活性，可用切口平移法（ nick translation ）標記 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反應。 28 （五）逆轉錄酶 逆轉錄酶是一種有效地轉錄 RNA產生 cDNA的酶 。對于所形成的單鏈突出，可用 DNA 聚合酶補平。 質粒廣泛存在于細菌之中，在某些藍藻、綠藻和真菌細胞中也存在質粒。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30 多個不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。 53 （ 4 ）卡那霉素和新霉素抗性基因（ kan r, neor） 卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結合并抑制蛋白質合成。 ?λDNA分子上有多種限制性內切酶的識別序列 ， 便于用這些酶切割產生外源 DNA片段的插入和置換 。 76 PCR 擴增，主要的是引物設計，引物設計需要遵循一定的原則。一般以 MgCl2 的形式提供，標準濃度為 。339。 90 3．反應時間 變性步驟一般使用 30 秒鐘，如果模板的 G+C 含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。只有當 PCR 反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。 ?整個 DNA的化學合成過程可以在一個反應柱上連續(xù)進行 ， 并且可以對合成過程進行計算機控制 。 補充內容：受體細胞選擇的一般原則 原核生物 動物細胞 119 目前已使用的受體細胞有三大類： （ 1） 微生物表達系統(tǒng) 最早使用和至今最廣泛使用的是 大腸桿菌 ， 其次是 酵母和枯草桿菌 。 磷酸鈣轉染法的基本原理 ：哺乳動物細胞能捕獲粘附在細胞表面的 DNA磷酸鈣沉淀物 ， 使 DNA轉入細胞 。 131 8 .激光微束穿孔法 利用直徑很小 、 能量很高的 激光微束 可引起細胞膜可逆性穿孔的原理 ， 用激光處理細胞 ， 處于細胞周圍的 重組 DNA隨之進入細胞 。 * 通過標記的探針 DNA與靶 DNA結合，檢測目的基因的存在及大小。 一、概念 146 顯微注射法： 將 DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過 DNA的胚胎移植到動物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。 美國占６６％，達３９００萬公頃，轉基因作物產量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉基因作物。 通常所說的動物克隆指 體細胞克隆 ，即動物的無性繁殖。 保存物種多樣性和瀕臨滅絕的動物 生產醫(yī)用器官、動物生物反應器 轉基因與動物克隆技術相結合，可降低生產成本。 加拿大占６％，達３５０萬公頃。然后將帶轉基因體細胞移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產重構胚胎。 * 因與 DNA的雜交（ Southern 雜交）相對應，故被趣稱為 Northern雜交。 基因導入的方法多種多樣 ， 可根據(jù)具體要求進行選擇 ， 具體操作也參考有關實驗手冊 。 125 3. 多聚物介導法 原理 ：多聚物同二價陽離子 (如 Mg2+,Ca2+,Mn2+等 )和 DNA混合 ， 可在原生質體表面形成顆粒沉淀 ，使 DNA進入細胞內 。 （ 3） 動物細胞表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞主要是胚胎細胞和培養(yǎng)的體細胞 ， 但培養(yǎng)條件苛刻 ， 成本較高 ， 且易污染 。 合成的 DNA片段可用于連接成一個長的完整基因，用于擴增目的基因 (PCR)、引入突變、作為測序引物，還可用于雜交。 ?3‘端絕對不能互補； ?兩引物具有較好的協(xié)調性； ?內部二級結構較少； ?加酶切位點是需要注意保護堿基長度； ?檢測特異性； 98 （七） PCR技術的應用 基因克隆 不對稱 PCR與 DNA序列測定 RTPCR與 RNA分析 基因的體外誘變與突變的檢測 基因組研究 99 RTPCR 100 基因文庫 (Gene library)包括 cDNA文庫(cDNA library)和 基因組文庫 (Genomic library)。延伸時間由擴增產物的大小決定，一般采用 1kb 用 1 分鐘來保證充足的時間。53