【正文】 菌中復(fù)制并遺傳。 如： pUC18/19： r BamH I pUC18 2,686 bp Amp lacZ39。 溫敏質(zhì)粒： 即溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒，在不同溫度 下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)。 2） 復(fù)制子經(jīng)人工誘變 ， 解除對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)控制作用 ， 使質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中達(dá)數(shù)千拷貝 。 實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)粒多以少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建： pSC101： ，拷貝數(shù) 5，四環(huán)素抗性基因 Tetr。 氨芐青霉素抗性（ ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（ kanamycin, Kanr） 四環(huán)素抗性（ tetracycline, Tetr） 鏈霉素抗性（ streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（ chloromycetin, Chlr） 常用的選擇標(biāo)記： 2）根據(jù)克隆子藍(lán)白顏色進(jìn)行篩選的 lacZ’基因。 1） 刪除不必要的 DNA區(qū)域 ， 滅活對(duì)質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)的基因 ，提高質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 。 可通過(guò)插入失活篩選 ， 但免疫篩選 E1的操作非常麻煩 。 按分子量大?。? 15kb，多為接合型質(zhì)粒； 15kb，多為非接合型質(zhì)粒。 R質(zhì)粒： 抗藥性質(zhì)粒， 帶有一種或多種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀。 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 這些標(biāo)記基因?qū)χ亟M DNA篩選 有重要意義 。 符合基因工程的 安全 要求 。 兩種含 相似 復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 在復(fù)制時(shí)受同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾 ， 致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同 ， 其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì) 。 2） 松弛型質(zhì)粒 (relaxed plasmid)： 如： pMB ColE1。 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的 DNA復(fù)制系統(tǒng) ，進(jìn)行自主復(fù)制 。 6） 編碼基因： 質(zhì)粒不是單純的寄生 ， 攜帶的遺傳信息賦予細(xì)菌特定的遺傳性狀 ， 如抗生素抗性基因 Ampr。 The genomic DNA of : a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell plasmid DNA Genomic DNA 4） 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價(jià) 、 閉合 、 環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)(covalently closed circular DNA, cccDNA)， 以超螺旋形式存在 。 載體 (vector)： 載體的功能： 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞； 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力； 載體應(yīng)具備的條件： 具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性 (可轉(zhuǎn)移性 )； 具有合適的篩選標(biāo)記。 3） 絕大多數(shù)質(zhì)粒是 DNA型的； 酵母的殺傷質(zhì)粒 (killer plasmid)是 RNA。 質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系： 質(zhì)粒對(duì)宿主的生存不是必需的 ， 只是 “ 友好 ”的 “ 借居 ” 宿主細(xì)胞中 。 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為： 松弛型質(zhì)粒 13拷貝 /cell，復(fù)制受細(xì)胞核控制，伴隨染色體 DNA復(fù)制而復(fù)制。 10200拷貝 /cell， 復(fù)制不受細(xì)胞核控制 ，染色體 DNA復(fù)制停止時(shí) ， 仍可進(jìn)行復(fù)制 。 不相容性的質(zhì)粒組成 不相容性群 ，如： ColE pMB1有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； pSC10 F、 RP4有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； p15A及其衍生質(zhì)粒有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。 2） 非接合型質(zhì)粒： 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用 ，如 ColE1質(zhì)粒 。 野生型質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因 ， 使寄主產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀 。 RTF: resistance trarnsfer factor Col質(zhì)粒： 大腸桿菌素質(zhì)粒 ， 帶有控制大腸桿菌素合成的基因 ， 合成大腸桿菌素 ， 殺死不含Col質(zhì)粒的親緣細(xì)菌 。 大型質(zhì)粒 : 小型質(zhì)粒 : 質(zhì)粒的構(gòu)建 分子量大； 野生型質(zhì)粒的特性提供了以其為基礎(chǔ)、人工構(gòu)建載體分子的可能。 ColE1的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素 E1， 唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I正好位于這個(gè)基因內(nèi)部 。 2） 滅活某些編碼基因 滅活促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的 mob基因 ，杜絕重組質(zhì)粒擴(kuò)散污染環(huán)境 ， 保證 DNA重組實(shí)驗(yàn)的 安全性 。 1） 抗生素抗性 基因： 3） 在選擇標(biāo)記基因內(nèi) ， 引入人工合成的多種限制酶連續(xù)酶切位點(diǎn)的 DNA短序列 ， 即 多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites, MCS)， 也稱多酶接頭(polylinker)。 ColE1： ， 拷貝數(shù) 2030（ 氯霉素誘導(dǎo)可達(dá)10003000） ， 大腸桿菌素基因 E1。 如： pBR322： pBR322 4,363 bp ori ROP ROI Sal I BamH I Tet r Pvu I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r Pst I 松弛復(fù)制型 拷貝數(shù) 50100/cell 含 Ampr、 Tetr p: plasmid； BR: 取自構(gòu)建者 ； 322: 實(shí)驗(yàn)室編號(hào) 。 溫度 37℃ 時(shí)，拷貝數(shù)很低； 溫度 40℃ 時(shí)，拷貝數(shù)很快增至 1000個(gè)以上。 ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT EcoR I Sst I Kpn I Sma I Xba I Sal I Pst I Sph I Hind III 拷貝數(shù) 20223000/cell 用于基因克隆和測(cè)序 多克隆位點(diǎn) MCS 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ University of California的 oriPBR32 AmprPBR322 pUC18/19正選擇標(biāo)記 lacZ’的顯色原理 : pUC18/19 Plac lacZ’ MCS ? OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBr底物： 5溴 4氯 3吲哚基 ?D半乳糖苷 （ Xgal） ?半乳糖苷酶 ?亞基 ? 誘導(dǎo)物：異丙基硫代半乳糖苷 （ IPTG） ClBrClBrONN5溴 4氯靛藍(lán) （ ?互補(bǔ)） 整合質(zhì)粒： 含整