【正文】 菌中復制并遺傳。 如： pUC18/19： r BamH I pUC18 2,686 bp Amp lacZ39。 溫敏質(zhì)粒： 即溫度敏感型復制控制質(zhì)粒，在不同溫度 下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)。 2） 復制子經(jīng)人工誘變 ， 解除對質(zhì)?？截悢?shù)的負控制作用 ， 使質(zhì)粒在每個細胞中達數(shù)千拷貝 。 實驗室用質(zhì)粒多以少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建： pSC101： ，拷貝數(shù) 5，四環(huán)素抗性基因 Tetr。 氨芐青霉素抗性（ ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（ kanamycin, Kanr） 四環(huán)素抗性（ tetracycline, Tetr） 鏈霉素抗性（ streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（ chloromycetin, Chlr） 常用的選擇標記： 2）根據(jù)克隆子藍白顏色進行篩選的 lacZ’基因。 1） 刪除不必要的 DNA區(qū)域 ， 滅活對質(zhì)粒復制產(chǎn)生負調(diào)控效應(yīng)的基因 ，提高質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 。 可通過插入失活篩選 ， 但免疫篩選 E1的操作非常麻煩 。 按分子量大?。? 15kb，多為接合型質(zhì)粒； 15kb，多為非接合型質(zhì)粒。 R質(zhì)粒： 抗藥性質(zhì)粒， 帶有一種或多種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀。 攜帶特殊的遺傳標記 這些標記基因?qū)χ亟M DNA篩選 有重要意義 。 符合基因工程的 安全 要求 。 兩種含 相似 復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 在復制時受同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾 ， 致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同 ， 其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢 。 2） 松弛型質(zhì)粒 (relaxed plasmid)： 如： pMB ColE1。 質(zhì)粒能利用寄主細胞的 DNA復制系統(tǒng) ，進行自主復制 。 6） 編碼基因： 質(zhì)粒不是單純的寄生 ， 攜帶的遺傳信息賦予細菌特定的遺傳性狀 ， 如抗生素抗性基因 Ampr。 The genomic DNA of : a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell plasmid DNA Genomic DNA 4） 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價 、 閉合 、 環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)(covalently closed circular DNA, cccDNA)， 以超螺旋形式存在 。 載體 (vector)： 載體的功能： 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞； 為外源基因提供復制能力或整合能力； 載體應(yīng)具備的條件： 具有針對受體細胞的親緣性或親和性 (可轉(zhuǎn)移性 )； 具有合適的篩選標記。 3） 絕大多數(shù)質(zhì)粒是 DNA型的； 酵母的殺傷質(zhì)粒 (killer plasmid)是 RNA。 質(zhì)粒與宿主細胞的關(guān)系： 質(zhì)粒對宿主的生存不是必需的 ， 只是 “ 友好 ”的 “ 借居 ” 宿主細胞中 。 嚴緊型質(zhì)粒 根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為： 松弛型質(zhì)粒 13拷貝 /cell，復制受細胞核控制，伴隨染色體 DNA復制而復制。 10200拷貝 /cell， 復制不受細胞核控制 ，染色體 DNA復制停止時 ， 仍可進行復制 。 不相容性的質(zhì)粒組成 不相容性群 ，如： ColE pMB1有相似復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； pSC10 F、 RP4有相似復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； p15A及其衍生質(zhì)粒有相似復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。 2） 非接合型質(zhì)粒： 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用 ，如 ColE1質(zhì)粒 。 野生型質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因 ， 使寄主產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀 。 RTF: resistance trarnsfer factor Col質(zhì)粒： 大腸桿菌素質(zhì)粒 ， 帶有控制大腸桿菌素合成的基因 ， 合成大腸桿菌素 ， 殺死不含Col質(zhì)粒的親緣細菌 。 大型質(zhì)粒 : 小型質(zhì)粒 : 質(zhì)粒的構(gòu)建 分子量大； 野生型質(zhì)粒的特性提供了以其為基礎(chǔ)、人工構(gòu)建載體分子的可能。 ColE1的篩選標志是大腸桿菌素 E1， 唯一的克隆位點 EcoR I正好位于這個基因內(nèi)部 。 2） 滅活某些編碼基因 滅活促進質(zhì)粒在細菌種間轉(zhuǎn)移的 mob基因 ，杜絕重組質(zhì)粒擴散污染環(huán)境 ， 保證 DNA重組實驗的 安全性 。 1） 抗生素抗性 基因： 3） 在選擇標記基因內(nèi) ， 引入人工合成的多種限制酶連續(xù)酶切位點的 DNA短序列 ， 即 多克隆位點(multiple cloning sites, MCS)， 也稱多酶接頭(polylinker)。 ColE1： ， 拷貝數(shù) 2030（ 氯霉素誘導可達10003000） ， 大腸桿菌素基因 E1。 如： pBR322： pBR322 4,363 bp ori ROP ROI Sal I BamH I Tet r Pvu I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r Pst I 松弛復制型 拷貝數(shù) 50100/cell 含 Ampr、 Tetr p: plasmid； BR: 取自構(gòu)建者 ； 322: 實驗室編號 。 溫度 37℃ 時，拷貝數(shù)很低； 溫度 40℃ 時，拷貝數(shù)很快增至 1000個以上。 ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT EcoR I Sst I Kpn I Sma I Xba I Sal I Pst I Sph I Hind III 拷貝數(shù) 20223000/cell 用于基因克隆和測序 多克隆位點 MCS 正選擇顏色標記 lacZ’ University of California的 oriPBR32 AmprPBR322 pUC18/19正選擇標記 lacZ’的顯色原理 : pUC18/19 Plac lacZ’ MCS ? OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBr底物： 5溴 4氯 3吲哚基 ?D半乳糖苷 （ Xgal） ?半乳糖苷酶 ?亞基 ? 誘導物：異丙基硫代半乳糖苷 （ IPTG） ClBrClBrONN5溴 4氯靛藍 （ ?互補） 整合質(zhì)粒： 含整