【正文】 殺死不含Col質(zhì)粒的親緣細(xì)菌 。 接合型質(zhì)粒 按轉(zhuǎn)移方式： 非接合型質(zhì)粒 按復(fù)制機(jī)理： 接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型。 嚴(yán)緊型質(zhì)粒： 松弛型質(zhì)粒： 非 接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬 松弛型。 按分子量大小： 15kb，多為接合型質(zhì)粒； 15kb，多為非接合型質(zhì)粒。 大型質(zhì)粒 : 小型質(zhì)粒 : 質(zhì)粒的構(gòu)建 分子量大； 野生型質(zhì)粒的特性提供了以其為基礎(chǔ)、人工構(gòu)建載體分子的可能。 野生型 質(zhì)粒的缺陷： 拷貝數(shù)低； 單一酶切位點(diǎn)少； 遺傳標(biāo)記不理想 。 如： 天然質(zhì)粒 pSC101分子量 ， 只有 1個(gè)EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn) ， 篩選標(biāo)志只有 Tetr。 可通過插入失活篩選 ， 但免疫篩選 E1的操作非常麻煩 。 ColE1的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素 E1， 唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I正好位于這個(gè)基因內(nèi)部 。 大于 20kb的質(zhì)粒很難導(dǎo)入受體細(xì)胞 ， 且極不穩(wěn)定 。 質(zhì)粒的改造與構(gòu)建： 盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子量 ， 提高外源 DNA的裝載量 。 1） 刪除不必要的 DNA區(qū)域 ， 滅活對(duì)質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)的基因 ，提高質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 。 2） 滅活某些編碼基因 滅活促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的 mob基因 ，杜絕重組質(zhì)粒擴(kuò)散污染環(huán)境 ， 保證 DNA重組實(shí)驗(yàn)的 安全性 。 最好有兩種選擇標(biāo)記基因 ， 并且在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn) 。 3） 加入選擇標(biāo)記基因： 當(dāng)外源 DNA片段插入克隆位點(diǎn)后 ， 標(biāo)記基因失活 ， 成為選擇克隆子的依據(jù) 。 氨芐青霉素抗性（ ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（ kanamycin, Kanr） 四環(huán)素抗性（ tetracycline, Tetr） 鏈霉素抗性（ streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（ chloromycetin, Chlr） 常用的選擇標(biāo)記： 2）根據(jù)克隆子藍(lán)白顏色進(jìn)行篩選的 lacZ’基因。 1） 抗生素抗性 基因： 3） 在選擇標(biāo)記基因內(nèi) ， 引入人工合成的多種限制酶連續(xù)酶切位點(diǎn)的 DNA短序列 ， 即 多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites, MCS)， 也稱多酶接頭(polylinker)。 同時(shí) 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) ， 使其單一化 。 4） 根據(jù)外源基因克隆的不同要求 ， 分別加裝特殊的基因 表達(dá)調(diào)控元件 。 實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)粒多以少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建： pSC101： ，拷貝數(shù) 5，四環(huán)素抗性基因 Tetr。 ColE1： ， 拷貝數(shù) 2030（ 氯霉素誘導(dǎo)可達(dá)10003000） ， 大腸桿菌素基因 E1。 RSF2124： ColE1衍生質(zhì)粒 ， 氨芐青霉素抗性基因 Ampr。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途，分為： 整合質(zhì)粒 測(cè)序質(zhì)粒 高拷貝質(zhì)粒 低拷貝質(zhì)粒 溫敏質(zhì)粒 探針質(zhì)粒 穿梭質(zhì)粒 表達(dá)質(zhì)粒 高拷貝質(zhì)粒： 1） 含有氯霉素可擴(kuò)增的松弛型復(fù)制子結(jié)構(gòu) ，如 ColE pMB1派生質(zhì)粒 、 pBR系列； 用于 克隆 和 擴(kuò)增 外源基因 。 2） 復(fù)制子經(jīng)人工誘變 ， 解除對(duì)質(zhì)粒拷貝數(shù)的負(fù)控制作用 ， 使質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中達(dá)數(shù)千拷貝 。 如： pBR322： pBR322 4,363 bp ori ROP ROI Sal I BamH I Tet r Pvu I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r Pst I 松弛復(fù)制型 拷貝數(shù) 50100/cell 含 Ampr、 Tetr p: plasmid； BR: 取自構(gòu)建者 ； 322: 實(shí)驗(yàn)室編號(hào) 。 用于基因克隆和擴(kuò)增 oriColE1 TetrpSC101 AmprpSP2124 低拷貝質(zhì)粒： 某些毒性基因的表達(dá)產(chǎn)物過多時(shí) ， 會(huì)嚴(yán)重影響宿主菌的正常代謝活動(dòng) 、 導(dǎo)致宿主菌死亡 ， 就需要低拷貝載體 。 如 pLG338/33 pHSG415等 pSC101派 生質(zhì)粒 ， 拷貝數(shù) 10， 用于 表達(dá) 某些 毒性基因 。 溫敏質(zhì)粒： 即溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒，在不同溫度 下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)。 溫度 37℃ 時(shí)，拷貝數(shù)很低； 溫度 40℃ 時(shí)，拷貝數(shù)很快增至 1000個(gè)以上。 如 ： 1979年 pBEU pBEU2： 測(cè)序質(zhì)粒： 高拷貝復(fù)制 ， 含有多克隆位點(diǎn) (MCS)， 便于外源 DNA的克隆與擴(kuò)增 ， 在 MCS兩端鄰近區(qū)域 ， 有 通用引物 互補(bǔ)序列 ， 便于 測(cè)序 。 如： pUC18/1 M13 mp系列、 pGEMT。 如： pUC18/19： r BamH I pUC18 2,686 bp Amp lacZ39。 ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT EcoR I Sst I Kpn I Sma I Xba I Sal I Pst I Sph I Hind III 拷貝數(shù) 20223000/cell 用于基因克隆和測(cè)序 多克隆位點(diǎn) MCS 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ University of California的 oriPBR32 AmprPBR322 pUC18/19正選擇標(biāo)記 lacZ’的顯色原理 : pUC18/19 Plac lacZ’ MCS ? OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBr底物： 5溴 4氯 3吲哚基 ?D半乳糖苷 （ Xgal） ?半乳糖苷酶 ?亞基 ? 誘導(dǎo)物：異丙基硫代半乳糖苷 （ IPTG） ClBrClBrONN5溴 4氯靛藍(lán) （ ?互補(bǔ)） 整合質(zhì)粒： 含整合酶編碼基因和整合特異性位點(diǎn)序列 ， 克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后 ， 能準(zhǔn)確整合在受體細(xì)胞染色體 DNA的特定位點(diǎn) 。 便于外源基因的 整合 。 穿梭質(zhì)粒 (shuttle plasmid)： 如： 、 。 克隆的外源基因可不用更換載體、直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體菌中復(fù)制并遺傳。 含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu) 、 相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因 ， 能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并被檢測(cè) 。 表達(dá)質(zhì)粒