克隆載體與表達(dá)載體-文庫吧
2025-07-21 03:01 本頁面
【正文】 粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)?？上笫删wλ一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。噬菌粒載體能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制能像M13DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞 裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（10 kb通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈DNA重組操作簡便，篩選容易 噬菌粒載體綜合了質(zhì)粒載體和M13噬菌體載體優(yōu)點，含有ColEl復(fù)制起始位點、抗生素抗性選擇標(biāo)記和絲狀體噬菌體DNA間隔區(qū)(含有噬菌體DNA復(fù)制起始、終止以及噬菌體顆粒形態(tài)發(fā)生所必需的全部順式作用元件)它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點、選擇性標(biāo)記、多克隆位點等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體1. 具有較小分子量基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；2. 編碼一個ampr基因作為選擇記號，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；3. 拷貝數(shù)含量高4. 存在著一個多克隆位點區(qū)，因此多種不同類型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；’端編碼區(qū)，可按照IPTG顯色反應(yīng)試驗篩選6. lacZ基因是置于lac啟動子的控制之下，插入的外源基因便會以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；7含有質(zhì)粒的復(fù)制起點，可復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子8. 帶有一個M13噬菌體的復(fù)制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.；在pUC118和pUC119這兩個載體中，多克隆位點區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNApUC118和pUC119人工染色體染色體具有復(fù)制功能，利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體稱為人工染色體載體其裝載外源DNA的容量比質(zhì)粒、噬菌體和噬菌體質(zhì)粒雜合載體等有很大的拓展，甚至可以跟染色體的大小相媲美。 人工染色體載體拷貝數(shù)少，制備困難，通常采取“穿梭載體”的策略來解決含有質(zhì)粒載體所必備的第一受體(大腸桿菌)質(zhì)粒復(fù)制起始位點，這樣的載體在大腸桿菌內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制， 含有第二受體(如酵母)端粒(TEL)、DNA復(fù)制起始位點(ARS)和著絲粒(CEN)以及合適的選擇標(biāo)記。載體在體外與目的DNA重組后轉(zhuǎn)化到第二受體細(xì)胞，按照染色體復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制和傳遞。 篩選第一受體的克隆子一般采用抗生素抗性選擇標(biāo)記；篩選第二受體的克隆子常用與受體互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型。酵母人工染色體載體YAC細(xì)菌人工染色體載體 BACP1噬菌體人工染色體載體PAC質(zhì)粒載體總結(jié)質(zhì)粒載體類型長度選擇標(biāo)記克隆位點pSC101天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)緊型、低拷貝型 kb四環(huán)素抗性Tetr7個克隆位點： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColE1天然質(zhì)粒，屬松弛型多拷貝型 kb大腸桿菌素（colicin）E1和對E1免疫的基因（immE1）EcoR I位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1），但仍然表現(xiàn)出對E1免疫型（ImmE1+）pBR322元件來源① 復(fù)制起點 orip MB1系列（來源于ColE1）的高拷貝型復(fù)制起點② Ampr基因 pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。4363bp氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個克隆位點。其中9個會導(dǎo)致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3個會導(dǎo)致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。 pUC系列（i）來自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點（ori）；（ii）氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原來的核酸內(nèi)切限制酶的單識別位點；（iii）大腸桿菌β半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ′基因；（iv）位于lacZ′基因中的靠近5′端的
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