【正文】 細(xì)菌人工染色體 （ bacterial artificial chromosome, BAC） 1992年 ， F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的 ， 裝載量 50300kb； BAC在 單一拷貝 。 構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路 。 當(dāng)這種 ?DNA進(jìn)入一般 ， 不能合成有活性的頭部蛋白 ， 也就不能被包裝和裂解細(xì)菌 ， 從而阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散 。 縮短長度： 插入型載體 取代型載體 根據(jù)切除的多少 ， 將 ?DNA分成兩類： 野生型 ?DNA上約 4050%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的 。 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ cos位點(diǎn) 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 ? DNA 48,502bp ?DNA上至少有 61個(gè)基因 溶菌周期 噬菌體的生活周期 溶源周期 烈性噬菌體 (virulent phage)只有溶菌周期。 便于外源基因的 整合 。 同時(shí) 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) ， 使其單一化 。 接合型質(zhì)粒 按轉(zhuǎn)移方式： 非接合型質(zhì)粒 按復(fù)制機(jī)理： 接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型。 不相容性 (inpatibility) 指任何兩種含相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中 。 具有較高的外源 DNA載裝能力； 具有多種單一的限制酶酶切位點(diǎn)； 具有與受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)； 基本概念： 2） 存在于細(xì)菌 、 真菌 、藍(lán)藻 、 酵母等細(xì)胞中 。 質(zhì)粒的基本特征： 自主復(fù)制性 不相容性 可轉(zhuǎn)移性 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 自主復(fù)制性 質(zhì)粒 DNA上的 復(fù)制子 結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系 。 值得注意的是 ， 某些非接合型質(zhì)粒（ 如 ColE1） 在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下 ， 也能發(fā)生 DNA轉(zhuǎn)移 ， 這個(gè)過程由 bom和 mob基因決定 。 質(zhì)粒的改造與構(gòu)建： 盡量縮小質(zhì)粒的相對分子量 ， 提高外源 DNA的裝載量 。 如 pLG338/33 pHSG415等 pSC101派 生質(zhì)粒 ， 拷貝數(shù) 10， 用于 表達(dá) 某些 毒性基因 。 質(zhì)粒 DNA的分離純化 氯化銫密度梯度離心法 堿裂解法 沸水浴法 氯化銫密度梯度離心法 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加 CsCl和溴化乙錠 超速離心過夜 proteins ocDNA LDNA cccDNA RNAs 在紫外燈下吸取 cccDNA 沸水浴法 用含 EDTA和 Triton X100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴 40 sec 離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒 DNA 堿裂解法 將菌體懸浮在含 EDTA的緩沖液中 加 NaOH與 SDS混合液，去膜釋放內(nèi)含物 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加高濃度 NaAc溶液，沉淀去除染色體、大部分蛋白質(zhì) 離心取上清，酚 氯仿處理，去除痕量蛋白質(zhì)、核酸酶 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 RNase處理殘余 RNA 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒純度高、周期長、設(shè)備要求高、溴乙錠污染； 堿裂解法 質(zhì)粒純度低、快速、操作簡便； 沸水浴法 質(zhì)粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。 DNA重組技術(shù)需 ?噬菌體進(jìn)入 狀態(tài) 。 當(dāng)外源 DNA插入 imm434時(shí) ， 基因滅活 ， 重組 ?DNA進(jìn)入溶菌循環(huán)， 形成透明斑 。 組裝成新的噬菌體 M13，擠出寄主細(xì)胞 M13通過雄性細(xì)菌的 F性須注入其 +DNA +DNA合成 DNA，形成雙鏈 RF DNA 復(fù)制 +DNA，轉(zhuǎn)錄 mRNA、翻譯形成噬菌體蛋白 +DNA +DNA 注入 +DNA 指導(dǎo)合成 M13外殼蛋白 轉(zhuǎn)錄 翻譯 mRNA 復(fù)制 +DNA 200個(gè) RF DNA DNA （每個(gè)細(xì)胞可釋放約 1000個(gè) M13顆粒） 組裝成子代 M13 M13基因組中只有基因 II和 IV之間存在一段507bp的 基因間隔區(qū) (intergenic region, IG區(qū) )。 通過克隆雙鏈 DNA，能獲得同等長度的單一單鏈DNA； 重要的噬菌粒載體 pUC118/119 = pUC18/19的 ori、 Ampr、 lacZ’、 MCS + M13IG、 ori 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Ampr M13IG pUC118/119 pUC118/119： 1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式 在宿主細(xì)胞沒有感染上 M13輔助噬菌體時(shí) ， 受 pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)控制 ， 每個(gè)細(xì)胞能達(dá) 500個(gè)拷貝 。 。 ? 噬菌粒（ phagemid） 是一類人工構(gòu)建的含 單鏈?zhǔn)删w 包裝序列 、 復(fù)制子和 質(zhì)粒 復(fù)制子 、 克隆位點(diǎn) 、標(biāo)記基因的特殊類型載體 。 M13單鏈?zhǔn)删w DNA 生物結(jié)構(gòu)： 外型呈絲狀； 由外殼包裝蛋白和單股正鏈 DNA組成； 基因組為 單鏈線性 DNA，長 kb； DNA上至少有 10個(gè)基因，均為增殖所必需。 限制酶酶切； 非必需區(qū)： 必需區(qū)： 加裝選擇標(biāo)記 野 生型 ?DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記。 整合由 ?DNA上 cI和 int基因的產(chǎn)物激活 ，這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì) 。 探針質(zhì)粒： 用于 篩選表達(dá)調(diào)控元件 ， 如啟動子 、 終止子 。 如： pBR322： pBR322 4,363 bp ori ROP ROI Sal I BamH I Tet r Pvu I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r Pst I 松弛復(fù)制型 拷貝數(shù) 50100/cell 含 Ampr、 Tetr p: plasmid； BR: 取自構(gòu)建者 ； 322: 實(shí)驗(yàn)室編號 。 ColE1的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素 E1， 唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I正好位于這個(gè)基因內(nèi)部 。 2） 非接合型質(zhì)粒：