基因的克隆方法大全-文庫吧
2025-04-27 23:26 本頁面
【正文】 連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序分析 缺點(diǎn)：技術(shù)要求高，耗時(shí)，工作量大 11 SH在 mRNA研究上的應(yīng)用機(jī)理： !! 不足之處：重復(fù)性差，靈敏度低，回收的 cDNA量有限。 特異表達(dá)基因的樣本（ TS） 無特異表達(dá)基因的樣本（ RS） 提取 mRNA 提取 mRNA cDNA cDNA 轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)錄 過量 雜交 TS的 CDNA純化、富集、擴(kuò)增 去除過量的 RS的 cDNA及雜交分子 12 ? 基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá)； ? 基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉； ? 不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。 差減雜交技術(shù)的應(yīng)用方面 ： 13 ? 抑制性差減雜交（ SSH） Tester樣本 mRNA Driver樣本 mRNA SfiI A cDNA cDNA SfiI B A B 混合，變性雜交 過量 A B PCR擴(kuò)增 5` 3` 14 ?應(yīng)用 ?基因突變體的研究：如基因的表達(dá)與不表達(dá) ?基因時(shí)空表達(dá)的研究：如根、莖、葉 ?不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)差異：如施肥與不施肥、光照與不光照 15 ? 差異顯示 PCR（ DD RTPCR） ?最先由 Liang等于 1992年報(bào)道，目前已廣泛在實(shí)驗(yàn)室使用。 ?主要原理：利用真核生物 mRNA結(jié)尾處有POLY（ A）結(jié)構(gòu)，在其 3`端設(shè)計(jì)象 5`T11GA樣引物，該引物可與 mRNA總數(shù)的十二分之一結(jié)合，從而使這部分基因得到逆轉(zhuǎn)錄，同時(shí)結(jié)合 5`端的隨機(jī)引物（ 20條 10mer），可以使不同長(zhǎng)度的基因得到擴(kuò)增。 5` 3` AAAAAAAA A T G C A G C TTTTTTTTTT RP mRNA 16 5` 3` AAAAAAAA A T G C A G C TTTTTTTTTT RP mRNA AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT
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