【正文】 intergenic region, IG區(qū) )。 重組 ?DNA需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒 ， 方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 。 當(dāng)外源 DNA插入 imm434時(shí) ， 基因滅活 ， 重組 ?DNA進(jìn)入溶菌循環(huán)， 形成透明斑 。 對(duì)某一限制酶只有單一切點(diǎn)，且通常只能用 這一種限制酶，如 ?gt系列。 DNA重組技術(shù)需 ?噬菌體進(jìn)入 狀態(tài) 。 溫和噬菌體 (temperate phage)既有溶源周期 ， 又有溶菌周期 。 質(zhì)粒 DNA的分離純化 氯化銫密度梯度離心法 堿裂解法 沸水浴法 氯化銫密度梯度離心法 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加 CsCl和溴化乙錠 超速離心過(guò)夜 proteins ocDNA LDNA cccDNA RNAs 在紫外燈下吸取 cccDNA 沸水浴法 用含 EDTA和 Triton X100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 沸水浴 40 sec 離心，用無(wú)菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒 DNA 堿裂解法 將菌體懸浮在含 EDTA的緩沖液中 加 NaOH與 SDS混合液，去膜釋放內(nèi)含物 加溶菌酶裂解細(xì)菌細(xì)胞壁 加高濃度 NaAc溶液，沉淀去除染色體、大部分蛋白質(zhì) 離心取上清，酚 氯仿處理，去除痕量蛋白質(zhì)、核酸酶 乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒 RNase處理殘余 RNA 氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒純度高、周期長(zhǎng)、設(shè)備要求高、溴乙錠污染； 堿裂解法 質(zhì)粒純度低、快速、操作簡(jiǎn)便； 沸水浴法 質(zhì)粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。 穿梭質(zhì)粒 (shuttle plasmid)： 如： 、 。 如 pLG338/33 pHSG415等 pSC101派 生質(zhì)粒 ， 拷貝數(shù) 10， 用于 表達(dá) 某些 毒性基因 。 4） 根據(jù)外源基因克隆的不同要求 ， 分別加裝特殊的基因 表達(dá)調(diào)控元件 。 質(zhì)粒的改造與構(gòu)建： 盡量縮小質(zhì)粒的相對(duì)分子量 ， 提高外源 DNA的裝載量 。 嚴(yán)緊型質(zhì)粒： 松弛型質(zhì)粒： 非 接合型質(zhì)粒分子量小，一般屬 松弛型。 值得注意的是 ， 某些非接合型質(zhì)粒（ 如 ColE1） 在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下 ， 也能發(fā)生 DNA轉(zhuǎn)移 ， 這個(gè)過(guò)程由 bom和 mob基因決定 。 分子機(jī)制： 兩種含 不同 復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 在復(fù)制時(shí)受各自的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)調(diào)節(jié) ， 致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定 ， 經(jīng)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后 ， 仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi) 。 質(zhì)粒的基本特征： 自主復(fù)制性 不相容性 可轉(zhuǎn)移性 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 自主復(fù)制性 質(zhì)粒 DNA上的 復(fù)制子 結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系 。 （二）質(zhì)粒 (plasmid) 1） 是生物細(xì)胞內(nèi)固有的 、能獨(dú)立于染色體而自主復(fù)制 、 并被穩(wěn)定遺傳的核酸分子 。 具有較高的外源 DNA載裝能力； 具有多種單一的限制酶酶切位點(diǎn)； 具有與受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)； 基本概念： 2） 存在于細(xì)菌 、 真菌 、藍(lán)藻 、 酵母等細(xì)胞中 。 質(zhì)粒離開(kāi)宿主就無(wú)法生存 ， 只有依賴宿主細(xì)胞的幫助 ， 才能完成自身的復(fù)制 、 轉(zhuǎn)錄 。 不相容性 (inpatibility) 指任何兩種含相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 不能同時(shí)存在于一個(gè)細(xì)胞中 。 雖帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息 ， 但失去了控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因 。 接合型質(zhì)粒 按轉(zhuǎn)移方式： 非接合型質(zhì)粒 按復(fù)制機(jī)理： 接合型質(zhì)粒分子量大，一般屬嚴(yán)緊型。 大于 20kb的質(zhì)粒很難導(dǎo)入受體細(xì)胞 ， 且極不穩(wěn)定 。 同時(shí) 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) ， 使其單一化 。 用于基因克隆和擴(kuò)增 oriColE1 TetrpSC101 AmprpSP2124 低拷貝質(zhì)粒： 某些毒性基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí) ， 會(huì)嚴(yán)重影響宿主菌的正常代謝活動(dòng) 、 導(dǎo)致宿主菌死亡 ， 就需要低拷貝載體 。 便于外源基因的 整合 。 通常裝有一個(gè)可定量檢測(cè)表達(dá)程度的 報(bào)告基因 （ 如抗生素抗性基因 ） ， 但缺少相應(yīng)的啟動(dòng)子或終止子 ， 因此本身不能表達(dá)報(bào)告基因 。 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ cos位點(diǎn) 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 ? DNA 48,502bp ?DNA上至少有 61個(gè)基因 溶菌周期 噬菌體的生活周期 溶源周期 烈性噬菌體 (virulent phage)只有溶菌周期。 在宿主生理狀態(tài)好 ， 即營(yíng)養(yǎng)條件適合 、 菌體代謝旺盛的情況下 ， cI基因關(guān)閉 ， 進(jìn)入溶菌狀態(tài)；在宿主生理狀態(tài)差的情況下 ， cI基因開(kāi)放 ， 進(jìn)入溶源狀態(tài) 。 縮短長(zhǎng)度： 插入型載體 取代型載體 根據(jù)切除的多少 ， 將 ?DNA分成兩類： 野生型 ?DNA上約 4050%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的 。 免疫功能類標(biāo)記 顏色反應(yīng)類標(biāo)記 需在 ?DNA非必需區(qū)加裝選擇標(biāo)記： 含完整 imm434基因的 ?DNA進(jìn)入 ， 建立溶源狀態(tài) ， 細(xì)菌生長(zhǎng)慢 ， 形成渾濁斑； 免疫功能類標(biāo)記 ： imm434 imm434編碼阻止 ?噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物 。 當(dāng)這種 ?DNA進(jìn)入一般 ， 不能合成有活性的頭部蛋白 ， 也就不能被包裝和裂解細(xì)菌 ， 從而阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散 。 2,700個(gè)外殼蛋白 不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)； M13噬菌體 M13的生活周期 注意： 雖不導(dǎo)致溶菌，但使菌斑混濁（細(xì)菌生長(zhǎng)變慢，為正常的 1/23/4）。 構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路 。 噬菌粒的特點(diǎn)： 能像 M13DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染 ； 裝載量比 M13mp系列大得多 （ 10 kb） ； 能像質(zhì)粒那樣在 ； 重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易。 細(xì)菌人工染色體 （ bacterial artificial chromosome, BAC） 1992年 ， F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的 ， 裝載量 50300kb； BAC在 單