【正文】 intergenic region, IG區(qū) )。 重組 ?DNA需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒 ， 方可高效導入受體細胞 。 當外源 DNA插入 imm434時 ， 基因滅活 ， 重組 ?DNA進入溶菌循環(huán)， 形成透明斑 。 對某一限制酶只有單一切點，且通常只能用 這一種限制酶，如 ?gt系列。 DNA重組技術需 ?噬菌體進入 狀態(tài) 。 溫和噬菌體 (temperate phage)既有溶源周期 ， 又有溶菌周期 。 質粒 DNA的分離純化 氯化銫密度梯度離心法 堿裂解法 沸水浴法 氯化銫密度梯度離心法 用含有 EDTA的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加 CsCl和溴化乙錠 超速離心過夜 proteins ocDNA LDNA cccDNA RNAs 在紫外燈下吸取 cccDNA 沸水浴法 用含 EDTA和 Triton X100的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細菌細胞壁 沸水浴 40 sec 離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質粒 DNA 堿裂解法 將菌體懸浮在含 EDTA的緩沖液中 加 NaOH與 SDS混合液，去膜釋放內含物 加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加高濃度 NaAc溶液，沉淀去除染色體、大部分蛋白質 離心取上清，酚 氯仿處理，去除痕量蛋白質、核酸酶 乙醇或異丙醇沉淀水相質粒 RNase處理殘余 RNA 氯化銫密度梯度離心法 質粒純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染； 堿裂解法 質粒純度低、快速、操作簡便； 沸水浴法 質粒純度、操作周期介于氯化銫法和沸水浴法之間。 穿梭質粒 (shuttle plasmid)： 如： 、 。 如 pLG338/33 pHSG415等 pSC101派 生質粒 ， 拷貝數(shù) 10， 用于 表達 某些 毒性基因 。 4） 根據外源基因克隆的不同要求 ， 分別加裝特殊的基因 表達調控元件 。 質粒的改造與構建： 盡量縮小質粒的相對分子量 ， 提高外源 DNA的裝載量 。 嚴緊型質粒： 松弛型質粒： 非 接合型質粒分子量小，一般屬 松弛型。 值得注意的是 ， 某些非接合型質粒（ 如 ColE1） 在接合型質粒的存在和協(xié)助下 ， 也能發(fā)生 DNA轉移 ， 這個過程由 bom和 mob基因決定 。 分子機制： 兩種含 不同 復制子結構的不同質粒 ， 在復制時受各自的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)調節(jié) ， 致使兩種質粒的最終拷貝數(shù)恒定 ， 經若干復制周期和細胞分裂周期后 ， 仍能共處于同一細胞內 。 質粒的基本特征： 自主復制性 不相容性 可轉移性 攜帶特殊的遺傳標記 自主復制性 質粒 DNA上的 復制子 結構決定了質粒與寄主的對應關系 。 （二）質粒 (plasmid) 1） 是生物細胞內固有的 、能獨立于染色體而自主復制 、 并被穩(wěn)定遺傳的核酸分子 。 具有較高的外源 DNA載裝能力； 具有多種單一的限制酶酶切位點； 具有與受體細胞相適應的復制位點或整合位點； 基本概念： 2） 存在于細菌 、 真菌 、藍藻 、 酵母等細胞中 。 質粒離開宿主就無法生存 ， 只有依賴宿主細胞的幫助 ， 才能完成自身的復制 、 轉錄 。 不相容性 (inpatibility) 指任何兩種含相似復制子結構的不同質粒 ， 不能同時存在于一個細胞中 。 雖帶有自我復制所必需的遺傳信息 ， 但失去了控制細菌配對和質粒接合轉移的基因 。 接合型質粒 按轉移方式： 非接合型質粒 按復制機理： 接合型質粒分子量大，一般屬嚴緊型。 大于 20kb的質粒很難導入受體細胞 ， 且極不穩(wěn)定 。 同時 刪除重復的酶切位點 ， 使其單一化 。 用于基因克隆和擴增 oriColE1 TetrpSC101 AmprpSP2124 低拷貝質粒： 某些毒性基因的表達產物過多時 ， 會嚴重影響宿主菌的正常代謝活動 、 導致宿主菌死亡 ， 就需要低拷貝載體 。 便于外源基因的 整合 。 通常裝有一個可定量檢測表達程度的 報告基因 （ 如抗生素抗性基因 ） ， 但缺少相應的啟動子或終止子 ， 因此本身不能表達報告基因 。 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ cos位點 頭部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重組基因 刪除與整合基因 ? DNA 48,502bp ?DNA上至少有 61個基因 溶菌周期 噬菌體的生活周期 溶源周期 烈性噬菌體 (virulent phage)只有溶菌周期。 在宿主生理狀態(tài)好 ， 即營養(yǎng)條件適合 、 菌體代謝旺盛的情況下 ， cI基因關閉 ， 進入溶菌狀態(tài)；在宿主生理狀態(tài)差的情況下 ， cI基因開放 ， 進入溶源狀態(tài) 。 縮短長度： 插入型載體 取代型載體 根據切除的多少 ， 將 ?DNA分成兩類： 野生型 ?DNA上約 4050%的片段是復制和裂解所非必需的 。 免疫功能類標記 顏色反應類標記 需在 ?DNA非必需區(qū)加裝選擇標記： 含完整 imm434基因的 ?DNA進入 ， 建立溶源狀態(tài) ， 細菌生長慢 ， 形成渾濁斑； 免疫功能類標記 ： imm434 imm434編碼阻止 ?噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物 。 當這種 ?DNA進入一般 ， 不能合成有活性的頭部蛋白 ， 也就不能被包裝和裂解細菌 ， 從而阻止有害重組體的生物污染及擴散 。 2,700個外殼蛋白 不裂解宿主細胞，但抑制其生長； M13噬菌體 M13的生活周期 注意： 雖不導致溶菌，但使菌斑混濁（細菌生長變慢，為正常的 1/23/4）。 構建考斯質粒和噬菌粒載體的思路 。 噬菌粒的特點： 能像 M13DNA那樣體外包裝，并高效轉染 ； 裝載量比 M13mp系列大得多 （ 10 kb） ； 能像質粒那樣在 ； 重組操作簡便，篩選容易。 細菌人工染色體 （ bacterial artificial chromosome, BAC） 1992年 ， F質粒的基礎上構建的 ， 裝載量 50300kb； BAC在 單