【正文】 裝載量大，為 350400kb； 染色體復(fù)制和遺傳的三個基本組件： DNA復(fù)制起始點（ ori） 著絲粒（ centromere） 兩個端粒（ telomeres） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的復(fù)制起點 ARS 酵母染色體的著絲粒 CEN4 酵母染色體的端粒 TEL 酵母篩選標記 TRP1 酵母篩選標記 URA3 ori Ampr CEN4 pYAC4 EcoR I URA3 TEL BamH I TEL ori Ampr TRP1 ARS1 TRP1： 色氨酸生物合成基因 URA3： 尿嘧啶生物合成基因 YAC載體的使用： pYAC4 CEN EcoR I URA TEL BamH I TEL ori Ampr TRP ARS EcoR I EcoR I EcoR I BamH I 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 幾種載體的最大裝載量： 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb plasmid ?DNA Cosmid BAC YAC 構(gòu)建其 cDNA文庫： 構(gòu)建其基因組文庫： 構(gòu)建動、植物和人類大型基因組文庫： 絕大多數(shù)真核生物 mRNA 10 kb： 載體常選 ?DNA、 Cosmid； 載體選 plasmid； 載體選 BAC或 YAC。 在細菌細胞中擴增； CMR：氯霉素抗性基因； parA、 parB：控制拷貝數(shù)； oriS、 repE：復(fù)制起點，控制質(zhì)粒單向復(fù)制； oriS、 repE、 parA、 parB來自性因子； Not I：用于切下外源 DNA。 細菌人工染色體 酵母人工染色體 將 細菌 接合因子或 酵母 染色體的復(fù)制區(qū) 、分配區(qū) 、 穩(wěn)定區(qū)與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 即構(gòu)成 人工染色體載體 (artificial chromosome)。 500 個拷貝 2）單鏈噬菌體滾環(huán)復(fù)制模式 當宿主細胞被 M13輔助噬菌體感染后 ，受 M13的復(fù)制起點控制 ， 按單鏈噬菌體滾環(huán)復(fù)制模式復(fù)制 。 Cosmid克隆的過程 用 CIP去除線性載體的 5’P， 可防止載體自連 。 將 噬菌體 DNA包裝有關(guān)序列 與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 既能縮短載體長度 、 提高裝載量 ， 又能保證重組 DNA在體外仍被包裝成有感染性的顆粒 。 常用的動物病毒載體 腺病毒 腺相關(guān)病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒 慢病毒 改造的猴腎病毒 SV40 痘苗病毒 皰疹病毒 昆蟲桿狀病毒 應(yīng)用動物病毒弱毒或無毒株 : （四）考斯質(zhì)粒與噬菌粒 ?DNA和 M13DNA載體的最大裝載量分別為 25kb和 ， 但很多情況下 ， 往往需要克隆更大的外源 DNA片段 。 該區(qū)存在 M13的 ori， 插入外源 DNA而不影響M13噬菌體的活力 ， 可作為克隆區(qū) 。 ?DNA的分離純化 將 加入 ?噬菌體懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1hr 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 412hr （噬菌體顆粒密度達 10131014/L， ） 超速離心，沉淀噬菌體 酚抽提，釋放 ?DNA 乙醇或異丙醇沉淀 ?DNA ?DNA作為載體的特點： 可在體外包裝成噬菌體顆粒，高效感染 ； 裝載容量大，最大 25 kb； 篩選方便； 提取比質(zhì)粒簡便； 適合外源基因的克隆和擴增，但不適合其表達。 重組 ?DNA的體外包裝 用于體外包裝的蛋白可直接從感染 ?噬菌體的 ， 已商品化 ， 通常為互補的兩部分：一部分 缺少 E組份 ， 另一部分 缺少 D組份 。 基因工程實驗中使用的受體是具有 琥珀型突變體校正功能 的菌株 。 噬菌體感染細菌形成的噬菌斑 空載體 ?DNA產(chǎn)生藍色透明斑； 顏色反應(yīng)類標記： lacZ lacZ基因編碼 ?半乳糖苷酶 ，在 IPTG誘導(dǎo)下 ， 能催化無色底物 Xgal生成藍色化合物 。 甲基化酶處理、定點突變。 體外包裝 插入位點 載體長度： 37 kb 體外包裝 插入片段 插入片段： 014 kb 插入型載體 (insertion vectors)： 取代型載體 (substitution vectors)： 載體長度： 26 kb 體外包裝 插入片段 插入片段： 1125 kb 含某一限制酶的兩個切點 ， 兩切點間的片段(可置換區(qū) )可被外源 DNA替代 ， 如 ?MBL系列 。 ?DNA載體的構(gòu)建 野生型 ?噬菌體 能包裝原 ?DNA長度的75105%（ 3751kb） ， 本身長度為 ， 只有當插入的外源 DNA片段 ≤ ， 才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 可根據(jù)需要 ， 改變 ?DNA或宿主細胞的性質(zhì) ， 使噬菌體或處于溶菌狀態(tài) ， 或處于溶源狀態(tài) 。 ?噬菌體感染 ， 除能裂解細胞（ 溶菌狀態(tài) ） 外 ， 還能將其 DNA整合到宿主細胞染色體 DNA上 ， 而不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒 ， 即 溶源狀態(tài) 。 溶菌周期： 吸附 LamB受體 注入 復(fù)制 包裝 裂解 感染細菌后 ， 立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼 ， 重新組裝成噬菌體顆粒 ， 并導(dǎo)致細菌細胞裂解 ， 釋放出大量子代噬菌體 。 噬菌體或病毒 DNA能被開發(fā)為基因工程載體的原因： 高效感染性 自主復(fù)制繁殖性 ?噬菌體 DNA 生物結(jié)構(gòu)： ?DNA為雙鏈線性 DNA，長 kb； ?噬菌體是 ； ?噬菌體由外殼包裝蛋白和 ?DNA組成； ?噬菌體能包裝原 ?DNA長度的75105%，約 3751kb； cos位點 對包裝至關(guān)重要。 （三）噬菌體或病毒 DNA 噬菌體 (bacteriophage)或病毒 (virus)是一類非細胞微生物 ， 能 高效率高特異性 地侵染宿主細胞 ， 然后或 自主復(fù)制繁殖 ， 或整合入宿主基因組中潛伏起來 ， 而且在一定條件下這兩種狀態(tài)會相互轉(zhuǎn)化 。 MCS lacZ’ PT7 ori Ampr 2,743 bp pGEM3Z PSP6 pET3a： pET28a： 只有含啟動子或終止子的外源 DNA插入載體的合適位點 ， 報告基因才能表達 ， 表達量的高低直接反映表達調(diào)控元件的強弱 。 克隆的外源基因可不用更換載體、直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體