【正文】 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome, YAC） 1983年， ； 1987年， 。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 3）噬菌粒載體的包裝 高效復(fù)制的噬菌粒單鏈 DNA被包裝成噬菌體顆粒，被擠出宿主細(xì)胞外。 考斯質(zhì)粒（ Cosmid） cos pHC79 kb Tetr 包裝相關(guān)序列 ori Ampr Pst I BamH I Sal I 1978年， ＆ 發(fā)明構(gòu)建 考斯質(zhì)粒： 是一類人工構(gòu)建的含有 ?DNA的 cos序列 、 包裝相關(guān)序列 + pBR322質(zhì)粒的復(fù)制子 、克隆位點(diǎn) 、 標(biāo)記基因的特殊類型載體； kb的 ?DNA片段 +pBR322片段； kb， 裝載范圍為 3145 kb。 被 M13感染的受體菌生長(zhǎng)緩慢 ， 形成混濁斑；重組 DNA越大 ， 混濁斑的混濁度越大 。 任何一種蛋白包裝液被重組 ?DNA污染 ，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 構(gòu)建琥珀型突變體 是指 CAG(Gln)向 UAG(stop)的突變 。 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 同時(shí) ， 為便于外源 DNA的克隆 ， 還需增加一些單一酶切位點(diǎn) 。 ?DNA的復(fù)制： ?型復(fù)制 滾環(huán)復(fù)制 感染晚期：?jiǎn)?dòng)滾環(huán)復(fù)制機(jī)制。 感染細(xì)菌后 ， 將自己的 DNA整合到細(xì)菌的染色體 DNA中 ， 形成原噬菌體 (prophage)， 這一過程稱為 溶源化(lysogenization)。 可使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。 表達(dá)質(zhì)粒： 在多克隆位點(diǎn)的上、下游，分別裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化元件，使外源基因能在受體細(xì)胞中 高效表達(dá) 、便于下游 純化 。 如 ： 1979年 pBEU pBEU2： 測(cè)序質(zhì)粒： 高拷貝復(fù)制 ， 含有多克隆位點(diǎn) (MCS)， 便于外源 DNA的克隆與擴(kuò)增 ， 在 MCS兩端鄰近區(qū)域 ， 有 通用引物 互補(bǔ)序列 ， 便于 測(cè)序 。 RSF2124： ColE1衍生質(zhì)粒 ， 氨芐青霉素抗性基因 Ampr。 最好有兩種選擇標(biāo)記基因 ， 并且在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn) 。 野生型 質(zhì)粒的缺陷： 拷貝數(shù)低； 單一酶切位點(diǎn)少； 遺傳標(biāo)記不理想 。 物質(zhì)抗性： 物質(zhì)合成： 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物 抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿 質(zhì)粒的空間構(gòu)型： 共價(jià)、閉合、環(huán)狀 DNA(cccDNA) 超螺旋 (super coil DNA, scDNA) 開環(huán) DNA(open circular DNA, ocDNA) 一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口 線形 DNA(linear DNA, LDNA) 質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率： 同一質(zhì)粒盡管分子量相同 ， 不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： cccDNA最快 、 LDNA次之 、ocDNA最慢 。 可轉(zhuǎn)移性 接合型質(zhì)粒 (conjunctive plasmid) 革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類： 非接合型質(zhì)粒 (nonconjunctive plasmid) 除帶有自我復(fù)制所必需的遺傳信息外 ， 還帶有一套控制細(xì)菌配對(duì)和質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移的基因 。 如： pSC10 p15A。 7）最大裝載量： 15 kb（ 5%） 。第二章 基因工程的基本條件 一、用于核酸操作的工具酶 二、 基因克隆載體 三、目的基因的制備 四、基因工程受體菌或細(xì)胞 二、基因克隆載體 （一）載體的功能及特征 （二）質(zhì)粒 （三）噬菌體或病毒 DNA （四） Cos質(zhì)粒與噬菌粒 （五）人工染色體載體 （一）載體的功能及特征 在基因工程操作中，能攜帶外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA分子。 5）分子大?。?1300 kb； 編碼 23個(gè)中等大小的蛋白質(zhì) ， 如抗生素抗性 、 代謝特征等 ， 賦予細(xì)菌一些額外的特性 （ 非必須 ） 。 1）嚴(yán)緊型質(zhì)粒 (stringent plasmid)： 加入 氯霉素 （ 終濃度 10170?g/ml） 抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后 ， 可達(dá) 3000拷貝 /cell 。 1） 接合型質(zhì)粒： 能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞 ， 如 F質(zhì)粒 。 cccDNA LDNA ocDNA 質(zhì)粒的分類 按功能： F質(zhì)粒 (fertility factor) R質(zhì)粒 (resistance factor) Col質(zhì)粒 (coliconogenic factor) 1） F質(zhì)粒： 性質(zhì)粒，決定細(xì)菌性別，能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。 如： 天然質(zhì)粒 pSC101分子量 ， 只有 1個(gè)EcoR I切點(diǎn)充當(dāng)克隆位點(diǎn) ， 篩選標(biāo)志只有 Tetr。 3） 加入選擇標(biāo)記基因： 當(dāng)外源 DNA片段插入克隆位點(diǎn)后 ， 標(biāo)記基因失活 ， 成為選擇克隆子的依據(jù) 。 人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途，分為： 整合質(zhì)粒 測(cè)序質(zhì)粒 高拷貝質(zhì)粒 低拷貝質(zhì)粒 溫敏質(zhì)粒 探針質(zhì)粒 穿梭質(zhì)粒 表達(dá)質(zhì)粒 高拷貝質(zhì)粒： 1） 含有氯霉素可擴(kuò)增的松弛型復(fù)制子結(jié)構(gòu) ，如 ColE pMB1派生質(zhì)粒 、 pBR系列； 用于 克隆 和 擴(kuò)增 外源基因 。 如： pUC18/1 M13 mp系列、 pGEMT。 pGEM3Z： 裝有 2個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子 裝有多克隆位點(diǎn) (MCS) 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ 用于外源基因的高效表達(dá) 注意： T7和 SP6啟動(dòng)子 特異性地由噬菌體 RNA聚合酶識(shí)別 ， 相應(yīng)的受體菌需表達(dá)噬菌體 RNA聚合酶 ， 如BL21(表達(dá) T7 RNA聚合酶 )。 可使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。 經(jīng)過若干世代后 ， 才從細(xì)菌染色體上脫離下來 ， 復(fù)制 、 合成噬菌體蛋白 ， 組裝成新的噬菌體， 導(dǎo)致菌體細(xì)胞裂解 。 形成多聯(lián)體 ?DNA分子 ， 必須在 cos 位點(diǎn) 被切斷成單體分子才能被包裝 。 野生型 ?DNA上有 5個(gè) EcoR I、 7個(gè) Hind III位點(diǎn) ， 不利于重組操作 ， 必須刪除至 12個(gè) 。 琥珀型突變 (sup)： ， 其編碼產(chǎn)物 校正 tRNA能專一性糾正這一突變 。 包裝時(shí) ， 當(dāng)且僅當(dāng) 這兩部分包裝蛋白與重組 ?DNA分子混合后 ， 包裝才能有效進(jìn)行 。 動(dòng)植物病毒 DNA 單鏈 DNA病毒 雙鏈 DNA病毒 單鏈 RNA病