【正文】 當大片段的外 源 DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體， 它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。 植物根部乙酰丁香酸 羥基乙酰丁香酸植物細胞Ti 質粒單鏈 TD N A根瘤菌細胞Ti 質粒的結構與功能 TDNA的染色體整合機制 表達特異性核酸內切酶單鏈 T D N A 整合在植物的基因組上在 LB 和 RB 的第三和第四個堿基之間切開2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 Agrobacterium tumefaciens, a soilborne αproteobacterium, has the capacity to transfer DNA from a resident tumor inducing (Ti) plasmid into eukaryotic cells where the oncogenic transferred DNA (TDNA) is integrated into the host genome and expressed. It is the only anism known to routinely engage in lateral gene transfer between Kingdoms, and the molecular basis of this transformation process has had considerable impact on studies of lateral DNA transfer and integration. In the case of Agrobacterium, virulent bacteria recognize signals produced at a host wound, phenols, monosaccharides, and low pH, as cues inducing expression of the Tiencoded virulence (vir) genes. The vir gene products, among other functions, are necessary for the processing and transport of the TDNA from the bacterium to the eukaryotic cell. TDNA的染色體整合機制 Ti 質粒的結構與功能 Ti 質粒的改造 除去 TDNA上的生長素 （ tms） 和分裂素 （ tmr） 生物合成基因 ， 因為大量的生長素和分裂素會抑止細胞再生長為整株植物； 除去 TDNA上的有機堿生物合成基因 （ tmt） ；因為有機堿的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸 ， 影響植物細胞的生長； 安裝大腸桿菌復制子 ， 使其能在大腸桿菌中復制 ， 以利于克隆操作； 安裝植物細胞的篩選標記 ， 如 neor 基因 ， 使用植物基因的啟動子和polyA化信號序列； 安裝多聚人工接頭以利于外源基因的克隆 。 RF Nicked by gene 2 protein + ssRolling circle replication, then cut and ligate Coated with gene 5 protein Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect. Linear M13 phage released from the cell. M13 DNA載體的構建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13mp系列載體 lacZ′ polylinker 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 M13克隆載體MCS與分子結構圖 M13 DNA載體的特點： 使克隆的 DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外 這在 DNA定向突變中非常有用 M13重組分子篩選簡便 被 M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混 濁斑，易于辨認挑選。 現(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。 “cosmid”一詞是由英文“ cos sitecarrying plasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點（ cos）的質粒。 下限不得少于正常野生型 DNA總量的 75％ λ噬菌體的包裝上限是 51kb。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 λDNA的體外包裝 λDNA的體外包裝作用，在離體條件下，將重組體 DNA包入噬菌體等病毒顆粒中的過程，以形成有功能的病毒載體 λ 噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進行的。 用替換型載體克隆外源 DNA包括三個步驟： 應用適當?shù)暮怂醿惹邢拗泼赶?λ載體，除去基因組中可取代的 DNA區(qū)段 DNA臂同外源 DNA片段連接。 體外包裝 插入位點 體外包裝 插入片段 載體長度 37 kb 插入片段大?。? 0 14 kb （ 51 – 37） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 具有成對的克隆位點，在這兩個位點之間的 DNA區(qū)段可以被外源插入的 DNA片段所取代 替換型載體（ replacement vectors） 替換型載體又叫做取代型載體（ substitution vector），是一類在 λ噬菌體基礎上改建的、在其中央部分有一個可以被外源插入的 DNA分子所取代的 DNA片段的克隆載體。當外源 DNA片段插入到這種位點上，不能進入溶源周期。 野生型 lDNA上約有 4050%的片段是復制和裂解所非必需的 。 Spi+ 如果 λ 噬菌體缺少兩個參與重組的基因 red 和 gam ，同時帶有 chi 位點 ，并且宿主菌為 rec + ，則可以在 P2 溶源性 中生長良好， λ噬菌體的這種表型稱作 Spi 。 ① lacZ 基因 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 ② cⅠ 基因 cⅠ 編碼的 λ抑制子 與操縱區(qū) OR1 和 OR2發(fā)生親和作用結合后，激活 PRM啟動 cⅠ 表達 λ抑制子，結合 Cro及下游裂解蛋白基因的表達，抑制裂解生長 溶原 裂解 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 hfl的 中， cⅠ 的表達使 λ 噬菌體進入溶源狀態(tài) hfl+的 中， λ噬菌體可高效率地進入溶源狀態(tài) Hfl：高頻溶源化， high frequency of lysogenization 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 重組子中外源基因插入到 cⅠ 中， cⅠ 不能表達 ,將高頻率地使 hfl 進入裂解生長狀態(tài)，長出噬菌斑。 可被 ga1 基因或 bio 基因替換，不影響 λ 噬菌體裂解生長 。 Circular form Linear form 3′GCCCCGCCGCTGGAGC5′ 5′CGGGGCGGCGACCTCG3′ Cleavage (during packaging) Ligation (after infection) GGGCGGGCGACCTCG3′ GC5′ 5′CG 3′GCCCCGCCGCTGGA 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 占 λ噬菌體 DNA 40－ 50% ，裂解生長所必須 右臂 約為 810kb ，從 PR 啟動子到右側 cos 位點。 T載體： 一個線性含 3`T突出端的載體用于直接高效地連接 PCR產物。 ② 適用于組織化學方法檢測 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pUC8質粒載體具有與 M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點 MCS區(qū)段，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿梭”。 pUC質粒載體的結構 包括 pUC 1 1 1 1 11 119等 （ i）來自 pBR322質粒的復制起點（ ori）； 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 （ ii）氨芐青霉素抗性基因（ ampr），但它的 DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點； （ iii）大腸桿菌 β半乳糖酶基因（ lacZ）的啟動子及其編碼 α肽鏈的 DNA序列，此結構特稱為 lacZ′基因； （ iv）位于 lacZ′基因中的靠近 5′端的一段多克隆位點（ MCS）區(qū)段，但它并不破壞該基因的功能 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 （ 2） pUC質粒載體的優(yōu)點 如 pUC8為 2 750bP， pUC18為 2686bP。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質粒載體 ① pBR322質粒載體的構建 (p93) 由 4 重要的大腸桿菌質粒載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質粒的三個不同來源的組成部分 ② pBR322質粒載體的優(yōu)點 pSF2124質粒易位子 Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ ampr） pSC101質粒的四環(huán)素抗性基因（ tetr） ColE1的派生質粒 pMB1的DNA復制起點（ ori） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 pBR322質粒載體優(yōu)點主要表現(xiàn)在以下幾個方面： 具有較小的分子量， pBR322質粒 DNA分子為 4 363bp。 正選擇的質粒載體 正選擇質粒載體（ direct selection vectors）：這種質粒載體具有直接選擇記號并賦予寄主細胞相應的表型。例如，pLG33 pLG339及 pHSG415。 在大腸桿菌中，常見的要用于基因克隆的天然質粒有ColE RSF2124和 pSC101等 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 現(xiàn)行通用的基因克隆載體，絕大多數(shù)就是以質粒為基礎改建而成的。 插入失活常被用于檢測含有外源 DNA的重組體，例如若在質粒 pBR322的 BamHI的位點插入外源 DNA，然后轉化大腸桿菌 (Tets、 Amps)。 底物 Xgal 還可充作生色劑，被 β半乳糖苷酶分解后可產生蘭色產物，可使菌落或噬菌斑呈蘭色。 若在該 DNA 小片段中再插入一個片段，將幾乎不可避免地導致產生無 α互補能力的 β半乳糖苷酶片段。 ① α互補（ αplementation） 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 lacZ′：只編碼 N端 140 個氨基酸的 lacZ 基因 ，其產物也沒有酶學活性。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 來自淀粉水解芽胞桿菌 （ Bacillus amyloliquefa ciens） ，編碼果聚糖蔗糖酶。 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 kanamycin/neomycin resistance gene, kanr, neor 2022年 3月 基因工程中－ Gene Engineering 第三章分子克隆載體 在基因的編碼區(qū)中，若某個密碼子發(fā)生突變后變成終止密碼子，則稱這樣的突變?yōu)?赭石突變（突變?yōu)? 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