【正文】 毒 雙鏈 RNA病毒 按基因組結(jié)構(gòu)，將動(dòng)植物病毒分成四類： 動(dòng)植物病毒克隆載體 雙鏈 DNA病毒：如花椰菜花葉病毒 (CaMV) 單鏈 DNA病毒：如番茄金黃花葉病毒 (TGMV) RNA病毒：如雀麥草花葉病毒 (TMV) 用于構(gòu)建克隆載體的植物病毒： RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的 DNA中間體 ，可作為載體進(jìn)行常規(guī)的 DNA重組。 cos site carrying plasmid； 考斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)： 能像 ?DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染 ； 裝載量大（ 45 kb） ； 能像質(zhì)粒那樣在 ； 制備與質(zhì)粒相同， 重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易 ； 與 ?DNA不同：不能體內(nèi)包裝，不裂解 。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 人工染色體載體 人類 、 動(dòng)物 、 植物的全基因組序列分析需克隆數(shù)百甚至上千 kb DNA片段 ， 此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量遠(yuǎn)不能滿足需要 。 按染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)建； 特點(diǎn)： 在酵母細(xì)胞中擴(kuò)增。 Hind III和 BamH I：克隆位點(diǎn)； BAC的組成： BAC主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster） ； 構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫(kù)（ gene library or gene bank）。 表示 M13輔助噬菌體 DNA 輔助噬菌體： 自身 ori突變 、 復(fù)制效率低 ， 但感染宿主細(xì)胞后 ， 能表達(dá)出外殼蛋白和復(fù)制蛋白 ， 幫助噬菌粒載體復(fù)制 ， 如 M13K07。 由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒 不攜帶包裝蛋白基因 ， 因此重組 DNA分子在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒 。 M13 DNA載體的構(gòu)建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型 M13 RFDNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13 mp系列載體 lacZ’ polylinker IG IG區(qū)內(nèi)只有 1個(gè) Bsu I 切點(diǎn) M13mp18的多克隆位點(diǎn)與 pUC18相同 M13 DNA載體的特點(diǎn)： 克隆的 DNA以單鏈形式輸出 ， 便于測(cè)序； M13重組子篩選簡(jiǎn)便； 最大缺陷是裝載量小，僅 kb。 這是基于 安全性 而設(shè)計(jì)的 。 當(dāng)外源基因插入 lacZ中 ， 基因滅活 ， 不能生成藍(lán)色化合物 。 取代型載體的 2個(gè) MCS區(qū)以 反向重復(fù) 形式位于?DNA非必需區(qū)的兩端 ， 通過(guò)酶切 ， 可將中間的非必需區(qū)切下來(lái) ， 與用相同酶酶切的外源 DNA置換 。 溶菌 感染早期：雙鏈進(jìn)行 ?型復(fù)制。 溶源周期： 整合到細(xì)菌染色體的 DNA隨細(xì)菌染色體復(fù)制而復(fù)制 。 噬菌體吸附在 噬菌體釋放、菌體裂解 T4噬菌體 The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle. The electron micrograph of the single linear DNA molecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp)。 含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu) 、 相應(yīng)的選擇標(biāo)記基因 ， 能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并被檢測(cè) 。 溫度 37℃ 時(shí)，拷貝數(shù)很低； 溫度 40℃ 時(shí)，拷貝數(shù)很快增至 1000個(gè)以上。 ColE1： ， 拷貝數(shù) 2030（ 氯霉素誘導(dǎo)可達(dá)10003000） ， 大腸桿菌素基因 E1。 2） 滅活某些編碼基因 滅活促進(jìn)質(zhì)粒在細(xì)菌種間轉(zhuǎn)移的 mob基因 ，杜絕重組質(zhì)粒擴(kuò)散污染環(huán)境 ， 保證 DNA重組實(shí)驗(yàn)的 安全性 。 大型質(zhì)粒 : 小型質(zhì)粒 : 質(zhì)粒的構(gòu)建 分子量大； 野生型質(zhì)粒的特性提供了以其為基礎(chǔ)、人工構(gòu)建載體分子的可能。 野生型質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因 ， 使寄主產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀 。 不相容性的質(zhì)粒組成 不相容性群 ，如： ColE pMB1有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； pSC10 F、 RP4有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容； p15A及其衍生質(zhì)粒有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容。 嚴(yán)緊型質(zhì)粒 根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為： 松弛型質(zhì)粒 13拷貝 /cell，復(fù)制受細(xì)胞核控制，伴隨染色體 DNA復(fù)制而復(fù)制。 3） 絕大多數(shù)質(zhì)粒是 DNA型的； 酵母的殺傷質(zhì)粒 (killer plasmid)是 RNA。 載體 (vector)： 載體的功能： 為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件。 6） 編碼基因： 質(zhì)粒不是單純的寄生 ， 攜帶的遺傳信息賦予細(xì)菌特定的遺傳性狀 ， 如抗生素抗性基因 Ampr。 2） 松弛型質(zhì)粒 (relaxed plasmid)： 如： pMB ColE1。 符合基因工程的 安全 要求 。 R質(zhì)粒： 抗藥性質(zhì)粒， 帶有一種或多種抗生素抗性基因，使寄主獲得同樣的抗生素抗性性狀。 可通過(guò)插入失活篩選 ， 但免疫篩選 E1的操作非常麻煩 。 氨芐青霉素抗性（ ampicillin, Ampr） 卡那霉素抗性（ kanamycin, Kanr） 四環(huán)素抗性（ tetracycline, Tetr） 鏈霉素抗性（ streptomycin, Strr） 氯霉素抗性（ chloromycetin, Chlr） 常用的選擇標(biāo)記： 2）根據(jù)克隆子藍(lán)白顏色進(jìn)行篩選的 lacZ’基因。 2） 復(fù)制子經(jīng)人工誘變 ， 解除對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)控制作用 ， 使質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中達(dá)數(shù)千拷貝 。 如： pUC18/19： r BamH I pUC18 2,686 bp Amp lacZ39。 MCS lacZ’ PT7 ori Ampr 2,743 bp pGEM3Z PSP6 pET3a： pET28a： 只有含啟動(dòng)子或終止子的外源 DNA插入載體的合適位點(diǎn) ， 報(bào)告基因才能表達(dá) ， 表達(dá)量的高低直接反映表達(dá)調(diào)控元件的強(qiáng)弱 。 噬菌體或病毒 DNA能被開(kāi)發(fā)為基因工程載體的原因： 高效感染性 自主復(fù)制繁殖性 ?噬菌體 DNA 生物結(jié)構(gòu)： ?DNA為雙鏈線性 DNA，長(zhǎng) kb； ?噬菌體是 ； ?噬菌體由外殼包裝蛋白和 ?DNA組成； ?噬菌體能包裝原 ?DNA長(zhǎng)度的75105%，約 3751kb； cos位點(diǎn) 對(duì)包裝至關(guān)重要。