克隆載體與表達(dá)載體-wenkub.com
2025-08-02 03:01 本頁面
【正文】 MAC哺乳動(dòng)物人工染色體?、?外源DNA片段的容量大；②不整合到宿主染色體上，不會(huì)破壞宿主基因組的結(jié)合和功能，可以穩(wěn)定地存在；③較少發(fā)生基因沉默現(xiàn)象MAC構(gòu)建的理論基礎(chǔ)在于將哺乳動(dòng)物染色體復(fù)制起始位點(diǎn)序列、端粒和著絲點(diǎn)分離出來，然后和一些載體元件組合構(gòu)成人工染色體，可以將外源基因及其調(diào)控序列引入哺乳動(dòng)物。TACTAC啟動(dòng)子。大片段表達(dá)載體 TAC可轉(zhuǎn)移人工載體結(jié)合了PAC和雙元載體的優(yōu)點(diǎn)：具有多克隆位點(diǎn)，具有P1復(fù)制子和RI質(zhì)粒復(fù)制子能在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中以單拷貝的形式穿梭復(fù)制。⑤病毒的外殼蛋白質(zhì)能夠識(shí)別細(xì)胞接受器。①含有能夠被真核細(xì)胞識(shí)別的有效的啟動(dòng)子。 2）反轉(zhuǎn)錄病毒的寄主范圍相當(dāng)廣，包括無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。反轉(zhuǎn)錄病毒載體泡沫病毒類從5’端開始依次是：①5’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(5’LTR)，帶有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列；②psi序列，又稱ψ序列，是病毒包裝所必須的信號(hào)序列；③gag，編碼病毒衣殼蛋白；④pol，編碼反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶(Int)；⑤env，編碼病毒顆粒外層包裝蛋白；⑥3’長(zhǎng)末端重復(fù)序列(3’LTR)，帶有poly A加尾信號(hào)序列。⑦對(duì)重組蛋白進(jìn)行定位的功能：如將核蛋白轉(zhuǎn)送到細(xì)胞核上，膜蛋白則定位在膜上，分泌蛋白則可分泌到細(xì)胞外等。③表達(dá)水平高：最高可使目的蛋白的量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的50％。除帶有病毒自身的復(fù)制起始位點(diǎn)外，還帶有pUC質(zhì)粒的復(fù)制子及以ampr，可以在細(xì)菌內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。 與共整合載體所不同的是，它不依賴兩個(gè)質(zhì)粒之間的同源序列，不需要共整合過程就能在農(nóng)桿菌內(nèi)獨(dú)立復(fù)制雙元表達(dá)載體構(gòu)件方便，轉(zhuǎn)化效率高于一元載體。在卸甲載體的TDNA區(qū)被刪除致瘤基因位點(diǎn)插入中間載體同源的質(zhì)粒序列，將中間載體轉(zhuǎn)入含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中，構(gòu)建在中間載體上目的基因可通過同源重組整合到卸甲載體Ti質(zhì)粒的TDNA區(qū)，并與卸甲載體Ti質(zhì)粒一起復(fù)制。Vir區(qū) 位于TDNA區(qū)的上游，其表達(dá)產(chǎn)物可激活TDNA向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，這一個(gè)區(qū)域也稱為致病區(qū)。Ti質(zhì)粒表達(dá)載體一元載體 一元載體就是含目的基因的中間表達(dá)載體與改造后的受體(Ti質(zhì)粒)通過同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，也稱為共整合載體。其余是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子酵母表達(dá)載體來自pBR322基本骨架 含有該質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。 YAC的構(gòu)建有比在細(xì)菌中克隆的一些優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)槟承┱婧思?xì)胞的序列，特別是重復(fù)序列是難以甚至不可能在細(xì)菌中繁殖的，酵母細(xì)胞卻具有這樣的能力細(xì)菌人工染色體載體 BAC是基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體每個(gè)環(huán)狀 DNA 分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記，一個(gè)來源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個(gè)易于 DNA 復(fù)制的由 ATP 驅(qū)動(dòng)的解旋酶（ （RepE） 以及三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）①以大腸桿菌為寄主，轉(zhuǎn)化率高，構(gòu)建BAC文庫比YAC文庫更容易；②BAC載體以環(huán)型超螺旋狀態(tài)存在，從大腸桿菌中提取質(zhì)粒較方便，而從酵母中分離DNA較困難； ③BAC的復(fù)制子來源于F因子，可穩(wěn)定遺傳，嵌合及重組現(xiàn)象少；④可以通過菌落原位雜交來篩選目的基因，方便快捷；⑤BAC載體在克隆位點(diǎn)的兩側(cè)具有T7和Sp6聚合酶啟動(dòng)子，可以用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA探針或直接用于插入片段的末端測(cè)序。而后，形成空斑。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。目前有很多公司推出了TA質(zhì)粒載體。TA載體耐熱聚合酶可在PCR產(chǎn)物的3’端加上一個(gè)非配對(duì)的脫氧腺嘌呤核苷(A)。4363bp氨芐青霉素和四環(huán)素抗性24個(gè)克隆位點(diǎn)。 人工染色體載體拷貝數(shù)少，制備困難，通常采取“穿梭載體”的策略來解決含有質(zhì)粒載體所必備的第一受體(大腸桿菌)質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)，這樣的載體在大腸桿菌內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制， 含有第二受體(如酵母)端粒(TEL)、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)(ARS)和著絲粒(CEN)以及合適的選擇標(biāo)記
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