基因工程32大腸桿菌克隆載體-wenkub.com
2025-01-03 02:22 本頁面
【正文】 這些載體中， 有的只對(duì)特定宿主有效的質(zhì)粒載體； 有的是能夠在許多宿主中復(fù)制的廣譜宿主質(zhì)粒； 還有少數(shù)幾個(gè)是從噬菌體開發(fā)出來的克隆載體。 基于噬菌體 P1發(fā)展而來的載體 P1優(yōu)于 λ 的地方：能夠在它的蛋白質(zhì)外殼中擠進(jìn) 110kb的 DNA。 減少克隆數(shù)的方法： 方法一：開發(fā)能夠攜帶更大 DNA片段的克隆載體。 據(jù)此，可以抽提出任何我們所感興趣的基因加以研究。 插入的外源 DNA片段： M13載體：不超過 3kb 質(zhì)粒：不超過 8kb 置換載體 λ EMBL4：達(dá)到 20kb 某些黏端質(zhì)粒： 40kb。 ? 如果插入的 DNA大小合適，體外包裝系統(tǒng)從cos位點(diǎn)切開連環(huán)體，把重組后的黏端質(zhì)粒包裝進(jìn)成熟的噬菌體顆粒。 因?yàn)樗鄙偎械?λ 噬菌體基因且不能產(chǎn)生噬菌斑，因此它需要有其他的篩選標(biāo)記，如氨芐青霉素耐藥性基因，也要有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。 黏端質(zhì)粒是噬菌體 DNA和大腸桿菌質(zhì)粒兩者的雜交體。 如果被插入的 DNA是正確的大小，那么分隔這些重復(fù)序列的 cos相隔正確的距離，能夠用于體外包裝。 如果增加一兩步操作，可以獲得更多的重組體 。 和 λ EMBL4相似，可以根據(jù)大小和 Spi表型篩選重組體。 在填充片段的兩邊各有一個(gè)多接頭，含有 7個(gè)不同的限制性酶切位點(diǎn)。 在填充片段的兩邊有成對(duì)的 EcoRI， BamHI和SalI的酶切位點(diǎn)。 通常被置換的那段 DNA（克隆術(shù)語中稱為填充片段）含有其他的一些限制性酶切位點(diǎn)，可被切成許多小片段，因此在克隆實(shí)驗(yàn)中它重新被插入的可能性相當(dāng)小。外源 DNA通過EcoRI單酶切位點(diǎn)插入 cI基因，并使該基因失活，使得重組體的噬菌斑是清澈的而不是混濁的。 最先產(chǎn)生的兩類載體 : λ 插入載體 (insertion) λ 置換載體 (替換載體 ) (replacement) 插入載體 插入載體的構(gòu)建過程： 去掉一大段非必需片段，剩下的兩段再連接起來。 選用可以產(chǎn)生 EcoRI的大腸桿菌做寄主，這樣大多數(shù)的噬菌體 DNA就被酶解掉了，但有少量的幸存者并產(chǎn)生了噬菌斑。 如果僅僅要移除一兩個(gè)這樣的識(shí)別位點(diǎn)，我們可以通過體外突變來解決。 這一段非必需片段實(shí)際上包含一些基因，它們和 λ 噬菌體整合與脫離大腸桿菌染色體相關(guān)。 從 λ 噬菌體基因組移除部分片段而不損傷其生存能力 發(fā)現(xiàn)：一個(gè)大的 DNA片段可以刪除。一旦 DNA的總長超過了 52kb，不能包裝進(jìn)入噬菌體的頭部，也就不能形成感染性的病毒顆粒。正常的 M13噬菌體是作為 輔助噬菌體 (helper phage)，提供必要的復(fù)制酶和蛋白質(zhì)外殼。 M13在形成被分泌的噬菌體顆粒前有一種酶使雙鏈 DNA變成單鏈 DNA，而被導(dǎo)入的那一段 M13 DNA則含有被這種酶識(shí)別的信號(hào)序列。 M13和質(zhì)粒的雜交載體 盡管 M13可以產(chǎn)生單鏈 DNA，這使它顯得非常有用，但它有很大一個(gè)缺點(diǎn)。 一種解決的方法就是 把 DNA換個(gè)方向，再插入到姐妹載體中 。 M13mp8姐妹載體 M13mp9有一個(gè)相同的多接頭，但是多接頭的方向相反，這使得它有另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。 更復(fù)雜的 M13載體 越精巧的 M13載體有更復(fù)雜的多接頭被插入到lacZ39。 如果是載體自連，噬菌斑應(yīng)該是什么顏色 ? 多接頭又一次顯示其巧妙設(shè)計(jì)：不管用哪一個(gè)內(nèi)切酶酶解，自連的載體都會(huì)連成有功能的 lacZ39。 在其他 DNA存在下，有 3種連接可能發(fā)生： (1)插入的新 DNA， (2)插入的多接頭。 M13mp7有 4個(gè)可能的克隆位點(diǎn)： EcoRI， BamHI， SalI和 PstI?；蛏咸砑宇~外的酶切位點(diǎn)?；?(第六個(gè)密碼子編碼天冬氨酰而不是天冬氨酸 )，但轉(zhuǎn)染了 M13mp2的細(xì)胞產(chǎn)生的 β 半乳糖苷酶仍然有著正常的功能?；蛏喜缓腥魏蔚南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，但在靠近基因起始位置的地方有一個(gè)GGATTC的序列。 M13mp2克隆載體的開發(fā) 構(gòu)建 M13克隆載體第一步，是把 lacZ39。 一個(gè)正常的 M13噬菌體的基因組是 ，為緊緊擠在一起的 10個(gè)基因所占據(jù)，每一個(gè)基因?qū)κ删w的復(fù)制都是必需的。 噬菌體的 DNA分子通常帶有幾個(gè)為復(fù)制所必需的基因，包括編碼噬菌體蛋白外殼的組分的基因和編碼噬菌體特有的復(fù)制酶的基因。 基于 M3噬菌體的克隆載體 對(duì)任何克隆載體而言，最基本的要求是能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制。 實(shí)際上這些啟動(dòng)子有的被 T7噬菌體編碼的 RNA聚合酶專一性識(shí)別，有的被 S
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