基因工程載體噬菌體載體-wenkub.com
2024-09-18 20:52 本頁(yè)面
【正文】 但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接； ② 大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來專門選出30～ 45kb的外源 DNA插入載體 DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度； ③ 細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一 DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間。凡具有 cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類似噬菌體 λ 的顆粒。 cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及 λ 噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。 ?噬菌體 頭部和尾部蛋白，可將 粘粒包裝成類似于 ?噬菌體 的具感染能力的顆粒，方便地進(jìn)入大腸桿菌。 可見， cosmid是由質(zhì)粒和 ?噬菌體的cos位點(diǎn) 構(gòu)建而成。 MCS的中部已經(jīng)切開，各有一個(gè) 3’端突出的 T。 常用的噬菌粒載體 pUC118和 pUC119 1. 具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組 DNA，可克隆 10kb的外源 DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作； 2. 編碼一個(gè) ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或 pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇； 3. 拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá) 500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA； 4. 存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類型的外源 DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上； 5. 由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌 lacZ基因的5’端編碼區(qū)，可按照 IPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子； 6. lacZ基因是置于 lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)； 7. 含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈 DNA分子 8. 帶有一個(gè) M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單 DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中； 9. 在 pUC118和 pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈 DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈 DNA； 10. 可以直接對(duì)克隆的 DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。 噬菌粒載體（ phagemid vectors） 由質(zhì)粒載體與單鏈?zhǔn)删w載體的復(fù)制起點(diǎn)結(jié)合而成的新型載體系列。 根據(jù) M13的生物學(xué)特性知道 ，M13子代噬菌體中總是只含有 （ ＋ ） 鏈 ， 所以 M13載體克隆的外源 DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈 ， 則完全取決于外源ＤＮＡ克隆時(shí)的取向 。 M13載體 ? 具有多克隆位點(diǎn) (MCS)，方便克隆。 在 IG區(qū)內(nèi)插入一個(gè)大腸桿菌的 LacZ’（ ?肽序列 )。 ?噬菌體顆粒的大小是受其ＤＮＡ的大小制約的，這一點(diǎn)正好與 λ 噬菌體相反。 M13噬菌體的特點(diǎn) ?感染 Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成雙鏈的復(fù)制型ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。 2. M13噬菌體能以 單鏈 和 雙鏈 兩種方式存在，因此可以用 感染 (經(jīng)包裝的單鏈 DNA)和 轉(zhuǎn)化 (雙鏈 DNA)。 。 篩選標(biāo)記： 藍(lán)白斑 (LacZ)、 噬菌斑 等。 由于 λ 噬菌體包裝時(shí)，當(dāng) DNA的長(zhǎng)度短于野生型的 78%或超過 105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。 換型噬菌體 λ 是使用最廣泛的載體 。 λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 5‘CGGGGCGGCGACCTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGGAGC5’ Cleavage Ligation (during packaging)
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