【正文】 *通過(guò)基因克隆的方法將 外源片段 克隆到轉(zhuǎn)遞質(zhì)粒上。 載體： 昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的組分： 昆蟲(chóng)細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn)： LOGO 病毒基因組相對(duì)較 大 ，不宜直接將外源基因克隆到病毒基因組。 因此，到目前為止， HBsAg重組疫苗還是在真核 CHO細(xì)胞或酵母中表達(dá)的。 轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌要與表達(dá)載體相 配套！ 三、外源基因在 LOGO IPTG addition IPTG Induction： adding IPTG to the culture if the vector uses Lac operon to regulate foreign gene expression. Quantity of target protein in cell, units LOGO Where your expressed protein will be located? Inclusion bodies (insoluble) Cytoplasm (soluble) Secreted into periplasmatic space (soluble or insoluble) Nothing Rebinant protein may be hydrolyzed by proteinases resistant to proteinase hydrolysis that results in the high yield LOGO SDSPAGE Purify and Identify the protein Western Blot Analysis 問(wèn)題： 是不是所有基因都可以在 ？ LOGO 外源基因在原核細(xì)胞表達(dá)的必要條件 ： 5’非編碼區(qū) SD順序控制下 （ ORF） ，形成的蛋白質(zhì)不被降解 LOGO 真核基因在 ？ （ 1）基因片段應(yīng)該來(lái)源于 mRNA，因?yàn)?。 LOGO O H OH H H H OH H OH CH2OH O H OH H H H H OH CH2OH O OH IPTG is an analog of lactose but can not be hydrolyzed by galactosidase. Lactose Why IPTG? (Isopropyl βD1thiogalactopyranoside, 異丙基硫代半乳糖苷 ) LOGO 乳糖操縱子的應(yīng)用： 利用乳糖操縱子的基本原理構(gòu)建原核細(xì)胞表達(dá)載體。 LOGO ?Plac： 受 Lac阻遏蛋白負(fù)調(diào)節(jié)， 受 IPTG的誘導(dǎo)。 原核生物作為基因表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞具有如下的特點(diǎn)： LOGO 二、原核表達(dá)載體 在 原核 細(xì)胞中 表達(dá) 外源基因的 載體 。 ③多數(shù)原核生物細(xì)胞內(nèi)含有質(zhì)?；蚴删w，便于構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。 真核表達(dá)系統(tǒng)： 外源基因引入 真核 細(xì)胞， 使外源 基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。 LOGO 3. 限制性內(nèi)切酶法 ： 根據(jù)限制酶切圖譜篩選特定 DNA 五、重組體的篩選與鑒定（篩） Linear vector (2700bp) insert (300bp) M 空質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 NcoI HindIII 2700bp 300bp 提取陽(yáng)性克隆的重組 DNA RE消化 電泳 有無(wú) DNA片段的插入； 插入片段的大小 連接前用什么酶， 就用什么酶切 LOGO 可明確序列和閱讀框的正確性 5. 核苷酸序列測(cè)定 是最準(zhǔn)確的鑒定目的 DNA的方法 五、重組體的篩選與鑒定（篩） ?利用序列特異性引物，可鑒定陽(yáng)性克隆。 539。 雙向連入載體 LOGO Vector SmaI HeaIII SmaI RE digestion RE digestion Vector Ligation Helf of smaI Rebinant vector SmaI Helf of HeaIII Rebinant vector SamI Helf of smaI Helf of HeaIII ② 平頭末端連接 ： 連接效率低 雙向連入載體 自身環(huán)化率高 LOGO Target gene EcoRI BamHI EcoRI BamHI Vector Vector digestion digestion Ligation Vector EcoRI BamHI ③ 雙酶消化的粘性末端連接： 連接效率高 。 這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因；還有真核生物的自主復(fù)制序列及選擇標(biāo)記性狀；具有多克隆位點(diǎn)。 （二）考慮目的 DNA的 大小 及受體細(xì)胞的種類和來(lái)源 載體 插入 DNA片段 宿主細(xì)胞 質(zhì)粒 5~10 kb 細(xì)菌，酵母 λ 噬菌體載體 ~ 20 kb 細(xì)菌 黏粒 ~50 kb 細(xì)菌 BAC ~400 kb 細(xì)菌 YAC ~3Mb 酵母 （三）含有合適的 MCS LOGO 克隆載體用于外源 DNA的克隆和無(wú)性繁殖 （一）克隆載體（ cloning vector） 應(yīng)具備的主要特點(diǎn) 復(fù)制起點(diǎn) （ origin of replication, ori） 選擇性標(biāo)志 （ selection marker） ： 多克隆位點(diǎn) （ multiple cloning sites， MCS） pBR322質(zhì)粒圖譜 LOGO 克隆載體用于外源 DNA的克隆和無(wú)性繁殖 （二）常用克隆載體的種類 (plasmid)是最常用的克隆載體 ?廣泛存在于細(xì)菌、酵母等多種微生物中 ?獨(dú)立于宿主細(xì)胞染色體外的環(huán)狀雙鏈的超螺旋結(jié)構(gòu) ?能在宿主細(xì)胞內(nèi) 獨(dú)立自主復(fù)制 ?帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些 遺傳性狀 ?質(zhì)粒的不相容性 ：兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象。 3’引物與擴(kuò)增片段 3’端的一小段 DNA序列互補(bǔ)。 GC比在 4555%。 ⑵ 堿基分布： ⑶ 引物方向： 5?→ 3? ⑷ 引物的 3?端 ：是 DNA延伸的起點(diǎn) ， 一定要嚴(yán)格與模板DNA配對(duì) 。 LOGO PCR引物設(shè)計(jì)的基本原則： 。 LOGO 轉(zhuǎn)膜、 變性、 封閉、 加入變性的探針、 雜交、 洗滌、 檢測(cè)雜交體。 ? 緩沖液或環(huán)境溫度也會(huì)影響一些酶的特異性。示切割位點(diǎn)） 識(shí)別位點(diǎn)通常為 6或 4堿基序列 LOGO 2. 識(shí)別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（ palindrome） 兩條核苷酸鏈中，從 5’到 3’方向的核苷酸序列完全一致 Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 3. 切割雙鏈 DNA分子后產(chǎn)生黏端或平端 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 黏端切口 （ sticky end） （ blunt end） Ⅱ 型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性： LOGO 粘性末端又可分為兩種： 1） 5?端突出 2） 3?端突出 ………CTGCA OH G……… ………G HOACGTC……… 5? 3? 5? 3? 5? 5? PstI ………CTGCA G……… …… C ACGTC……… 5? 5? 3? 3? ………G OH AATTC……. ………CTTAA HOG…… 5? 3? 5? 5? 5? 3? EcoRI ………GAATTC……… …… CTTAAG……… 5? 3? 5? 3? LOGO 4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 同尾酶 （ isocaudarner）： 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾酶。 LOGO 一、目的 DNA的 分 離獲?。ǚ郑? 二、載體的選 擇 與準(zhǔn)備（擇）； 三、目的 DNA與載體連 接 （接）； 四、重組 DNA轉(zhuǎn) 入受體細(xì)胞（轉(zhuǎn)）； 五、重組體的 篩 選與鑒定（篩）。 LOGO 基因克隆胚芽造就健康嬰兒 基因的秘密隨著科技的日益發(fā)達(dá)而被逐漸揭開(kāi)。這樣 ,科學(xué)家就可以很容易識(shí)別它們。LOGO 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 分子生物學(xué)教研室 講 師 孫 巍 Tel: 0431 85619369 202210 基因克隆、 克隆基因的表達(dá) LOGO 熒光蛋白基因克隆貓 科學(xué)家復(fù)活冰凍死老鼠 修正基因蚊子防控疾病 基因轉(zhuǎn)換讓蝌蚪長(zhǎng)出三顆眼睛 基因克隆胚芽造就健康嬰兒 基因克隆趣聞 LOGO 熒光蛋白基因克隆貓 具有熒光蛋白基因的克隆貓?jiān)谧贤饩€照射下會(huì)變色 由韓國(guó)科學(xué)技術(shù)部公布的對(duì)比照片顯示出 3只具有熒光蛋白基因的克隆貓（上圖為普通光線照射下，下圖為紫外線照射下） LOGO 科學(xué)家復(fù)活冰凍死老鼠 一只老鼠死亡后被冷凍了16年之久 ,日本科學(xué)家從其體內(nèi)提取基因克隆了一只新老鼠 ,這是人類首次成功克隆冷凍動(dòng)物。 LOGO 基因轉(zhuǎn)換讓蝌蚪長(zhǎng)出三顆眼睛 2022年 ,英國(guó)科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室中利用基因轉(zhuǎn)換技術(shù)成功地在蝌蚪頭部培育出第三顆眼球。血友病、色盲、白化病 …… 這