【正文】 ?噬菌體感染 ， 除能裂解細(xì)胞（ 溶菌狀態(tài) ） 外 ， 還能將其 DNA整合到宿主細(xì)胞染色體 DNA上 ， 而不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒 ， 即 溶源狀態(tài) 。 ?DNA載體的構(gòu)建 野生型 ?噬菌體 能包裝原 ?DNA長度的75105%（ 3751kb） ， 本身長度為 ， 只有當(dāng)插入的外源 DNA片段 ≤ ， 才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 甲基化酶處理、定點(diǎn)突變。 基因工程實(shí)驗(yàn)中使用的受體是具有 琥珀型突變體校正功能 的菌株 。 ?DNA的分離純化 將 加入 ?噬菌體懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1hr 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 412hr （噬菌體顆粒密度達(dá) 10131014/L， ） 超速離心，沉淀噬菌體 酚抽提，釋放 ?DNA 乙醇或異丙醇沉淀 ?DNA ?DNA作為載體的特點(diǎn)： 可在體外包裝成噬菌體顆粒，高效感染 ； 裝載容量大，最大 25 kb； 篩選方便； 提取比質(zhì)粒簡便； 適合外源基因的克隆和擴(kuò)增，但不適合其表達(dá)。 常用的動物病毒載體 腺病毒 腺相關(guān)病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒 慢病毒 改造的猴腎病毒 SV40 痘苗病毒 皰疹病毒 昆蟲桿狀病毒 應(yīng)用動物病毒弱毒或無毒株 : （四）考斯質(zhì)粒與噬菌粒 ?DNA和 M13DNA載體的最大裝載量分別為 25kb和 ， 但很多情況下 ， 往往需要克隆更大的外源 DNA片段 。 Cosmid克隆的過程 用 CIP去除線性載體的 5’P， 可防止載體自連 。 細(xì)菌人工染色體 酵母人工染色體 將 細(xì)菌 接合因子或 酵母 染色體的復(fù)制區(qū) 、分配區(qū) 、 穩(wěn)定區(qū)與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 即構(gòu)成 人工染色體載體 (artificial chromosome)。 裝載量大，為 350400kb； 染色體復(fù)制和遺傳的三個(gè)基本組件： DNA復(fù)制起始點(diǎn)（ ori） 著絲粒（ centromere） 兩個(gè)端粒（ telomeres） YAC載體應(yīng)含有下列元件： 酵母染色體的復(fù)制起點(diǎn) ARS 酵母染色體的著絲粒 CEN4 酵母染色體的端粒 TEL 酵母篩選標(biāo)記 TRP1 酵母篩選標(biāo)記 URA3 ori Ampr CEN4 pYAC4 EcoR I URA3 TEL BamH I TEL ori Ampr TRP1 ARS1 TRP1： 色氨酸生物合成基因 URA3： 尿嘧啶生物合成基因 YAC載體的使用： pYAC4 CEN EcoR I URA TEL BamH I TEL ori Ampr TRP ARS EcoR I EcoR I EcoR I BamH I 連接 轉(zhuǎn)化酵母菌 重組酵母染色體 幾種載體的最大裝載量： 15 kb 25 kb 45 kb 300 kb 400 kb plasmid ?DNA Cosmid BAC YAC 構(gòu)建其 cDNA文庫： 構(gòu)建其基因組文庫： 構(gòu)建動、植物和人類大型基因組文庫： 絕大多數(shù)真核生物 mRNA 10 kb： 載體常選 ?DNA、 Cosmid； 載體選 plasmid； 載體選 BAC或 YAC。 在細(xì)菌細(xì)胞中擴(kuò)增； CMR：氯霉素抗性基因； parA、 parB：控制拷貝數(shù)； oriS、 repE：復(fù)制起點(diǎn)，控制質(zhì)粒單向復(fù)制； oriS、 repE、 parA、 parB來自性因子； Not I：用于切下外源 DNA。 500 個(gè)拷貝 2）單鏈?zhǔn)删w滾環(huán)復(fù)制模式 當(dāng)宿主細(xì)胞被 M13輔助噬菌體感染后 ，受 M13的復(fù)制起點(diǎn)控制 ， 按單鏈?zhǔn)删w滾環(huán)復(fù)制模式復(fù)制 。 將 噬菌體 DNA包裝有關(guān)序列 與 質(zhì)粒 組裝在一起 ， 既能縮短載體長度 、 提高裝載量 ， 又能保證重組 DNA在體外仍被包裝成有感染性的顆粒 。 該區(qū)存在 M13的 ori， 插入外源 DNA而不影響M13噬菌體的活力 ， 可作為克隆區(qū) 。 重組 ?DNA的體外包裝 用于體外包裝的蛋白可直接從感染 ?噬菌體的 ， 已商品化 ， 通常為互補(bǔ)的兩部分：一部分 缺少 E組份 ， 另一部分 缺少 D組份 。 噬菌體感染細(xì)菌形成的噬菌斑 空載體 ?DNA產(chǎn)生藍(lán)色透明斑； 顏色反應(yīng)類標(biāo)記： lacZ lacZ基因編碼 ?半乳糖苷酶 ，在 IPTG誘導(dǎo)下 ， 能催化無色底物 Xgal生成藍(lán)色化合物 。 體外包裝 插入位點(diǎn) 載體長度： 37 kb 體外包裝 插入片段 插入片段： 014 kb 插入型載體 (insertion vectors)： 取代型載體 (substitution vectors)： 載體長度： 26 kb 體外包裝 插入片段 插入片段： 1125 kb 含某一限制酶的兩個(gè)切點(diǎn) ， 兩切點(diǎn)間的片段(可置換區(qū) )可被外源 DNA替代 ， 如 ?MBL系列 。 可根據(jù)需要 ， 改變 ?DNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì) ， 使噬菌體或處于溶菌狀態(tài) ， 或處于溶源狀態(tài) 。 溶菌周期： 吸附 LamB受體 注入 復(fù)制 包裝 裂解 感染細(xì)菌后 ， 立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼 ， 重新組裝成噬菌體顆粒 ， 并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞裂解 ， 釋放出大量子代噬菌體 。 （三）噬菌體或病毒 DNA 噬菌體 (bacteriophage)或病毒 (virus)是一類非細(xì)胞微生物 ， 能 高效率高特異性 地侵染宿主細(xì)胞 ， 然后或 自主復(fù)制繁殖 ， 或整合入宿主基因組中潛伏起來 ， 而且在一定條件下這兩種狀態(tài)會相互轉(zhuǎn)化 。 克隆的外源基因可不用更換載體、直接從一種受體菌轉(zhuǎn)入另一種受體菌中復(fù)制并遺傳。 溫敏質(zhì)粒： 即溫度敏感型復(fù)制控制質(zhì)粒，在不同溫度 下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)。 實(shí)驗(yàn)室用質(zhì)粒多以少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建： pSC101： ，拷貝數(shù) 5，四環(huán)素抗性基因 Tetr。 1） 刪除不必要的 DNA區(qū)域 ， 滅活對質(zhì)粒復(fù)制產(chǎn)生負(fù)調(diào)控效應(yīng)的基因 ，提高質(zhì)粒的 拷貝數(shù) 。 按分子量大小： 15kb，多為接合型質(zhì)粒； 15kb，多為非接合型質(zhì)粒。 攜帶特殊的遺傳標(biāo)記 這些標(biāo)記基因?qū)χ亟M DNA篩選 有重要意義 。 兩種含 相似 復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒 ， 在復(fù)制時(shí)受同一拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾 ， 致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同 ， 其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后