【正文】 的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì) 。 質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的 DNA復(fù)制系統(tǒng) ，進(jìn)行自主復(fù)制 。 The genomic DNA of : a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell plasmid DNA Genomic DNA 4） 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價(jià) 、 閉合 、 環(huán)狀的雙鏈結(jié)構(gòu)(covalently closed circular DNA, cccDNA)， 以超螺旋形式存在 。 運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞； 為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力； 載體應(yīng)具備的條件： 具有針對(duì)受體細(xì)胞的親緣性或親和性 (可轉(zhuǎn)移性 )； 具有合適的篩選標(biāo)記。 質(zhì)粒與宿主細(xì)胞的關(guān)系： 質(zhì)粒對(duì)宿主的生存不是必需的 ， 只是 “ 友好 ”的 “ 借居 ” 宿主細(xì)胞中 。 10200拷貝 /cell， 復(fù)制不受細(xì)胞核控制 ，染色體 DNA復(fù)制停止時(shí) ， 仍可進(jìn)行復(fù)制 。 2） 非接合型質(zhì)粒： 不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用 ，如 ColE1質(zhì)粒 。 RTF: resistance trarnsfer factor Col質(zhì)粒： 大腸桿菌素質(zhì)粒 ， 帶有控制大腸桿菌素合成的基因 ， 合成大腸桿菌素 ， 殺死不含Col質(zhì)粒的親緣細(xì)菌 。 ColE1的篩選標(biāo)志是大腸桿菌素 E1， 唯一的克隆位點(diǎn) EcoR I正好位于這個(gè)基因內(nèi)部 。 1） 抗生素抗性 基因： 3） 在選擇標(biāo)記基因內(nèi) ， 引入人工合成的多種限制酶連續(xù)酶切位點(diǎn)的 DNA短序列 ， 即 多克隆位點(diǎn)(multiple cloning sites, MCS)， 也稱多酶接頭(polylinker)。 如： pBR322： pBR322 4,363 bp ori ROP ROI Sal I BamH I Tet r Pvu I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r Pst I 松弛復(fù)制型 拷貝數(shù) 50100/cell 含 Ampr、 Tetr p: plasmid； BR: 取自構(gòu)建者 ； 322: 實(shí)驗(yàn)室編號(hào) 。 ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT EcoR I Sst I Kpn I Sma I Xba I Sal I Pst I Sph I Hind III 拷貝數(shù) 20223000/cell 用于基因克隆和測(cè)序 多克隆位點(diǎn) MCS 正選擇顏色標(biāo)記 lacZ’ University of California的 oriPBR32 AmprPBR322 pUC18/19正選擇標(biāo)記 lacZ’的顯色原理 : pUC18/19 Plac lacZ’ MCS ? OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBr底物： 5溴 4氯 3吲哚基 ?D半乳糖苷 （ Xgal） ?半乳糖苷酶 ?亞基 ? 誘導(dǎo)物：異丙基硫代半乳糖苷 （ IPTG） ClBrClBrONN5溴 4氯靛藍(lán) （ ?互補(bǔ)） 整合質(zhì)粒： 含整合酶編碼基因和整合特異性位點(diǎn)序列 ， 克隆在這種質(zhì)粒上的外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后 ， 能準(zhǔn)確整合在受體細(xì)胞染色體 DNA的特定位點(diǎn) 。 探針質(zhì)粒： 用于 篩選表達(dá)調(diào)控元件 ， 如啟動(dòng)子 、 終止子 。 ?DNA兩端各有 12個(gè)核苷酸組成的 5’突出粘性末端 (cohensiveend)， 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ ?DNA 二者的核苷酸 序列互補(bǔ)， 進(jìn)入宿主細(xì)胞后 ， 粘性末端連接成環(huán)狀 DNA分子 ， 此末端稱為 cos位點(diǎn) (cohensiveend site)。 整合由 ?DNA上 cI和 int基因的產(chǎn)物激活 ，這兩個(gè)基因的開放與關(guān)閉又取決于宿主細(xì)胞本身的性質(zhì) 。 縮短野生型 ?DNA長(zhǎng)度 ， 可提高裝載量 。 限制酶酶切； 非必需區(qū)： 必需區(qū)： 加裝選擇標(biāo)記 野 生型 ?DNA上缺少合適的選擇標(biāo)記。 將野生型 ?DNA上 D和 E兩個(gè)頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG。 M13單鏈?zhǔn)删w DNA 生物結(jié)構(gòu)： 外型呈絲狀； 由外殼包裝蛋白和單股正鏈 DNA組成； 基因組為 單鏈線性 DNA，長(zhǎng) kb； DNA上至少有 10個(gè)基因，均為增殖所必需。 考斯質(zhì)粒和噬菌粒的構(gòu)建就是為了進(jìn)一步提高噬菌體 DNA的裝載量。 ? 噬菌粒（ phagemid） 是一類人工構(gòu)建的含 單鏈?zhǔn)删w 包裝序列 、 復(fù)制子和 質(zhì)粒 復(fù)制子 、 克隆位點(diǎn) 、標(biāo)記基因的特殊類型載體 。 當(dāng)大片段外源 DNA克隆在人工染色體載體上 ， 便形成重組人工染色體 ， 它能像天然染色體那樣 ， 在受體細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制并遺傳 。 。 裝載量大，為 300 kb； BAC的特點(diǎn)： 單拷貝復(fù)制； 可以像提取質(zhì)粒一樣直接提取克隆的 DNA。 通過克隆雙鏈 DNA，能獲得同等長(zhǎng)度的單一單鏈DNA； 重要的噬菌粒載體 pUC118/119 = pUC18/19的 ori、 Ampr、 lacZ’、 MCS + M13IG、 ori 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Ampr M13IG pUC118/119 pUC118/119： 1）雙鏈質(zhì)粒復(fù)制模式 在宿主細(xì)胞沒有感染上 M13輔助噬菌體時(shí) ， 受 pUC本身的復(fù)制起點(diǎn)控制 ， 每個(gè)細(xì)胞能達(dá) 500個(gè)拷貝 。 在包裝上限固定的條件下 ， 大幅度縮短噬菌體 DNA的長(zhǎng)度 ， 就能同步增加載體的裝載能力 。 組裝成新的噬菌體 M13，擠出寄主細(xì)胞 M13通過雄性細(xì)菌的 F性須注入其 +DNA +DNA合成 DNA，形成雙鏈 RF DNA 復(fù)制 +DNA，轉(zhuǎn)錄 mRNA、翻譯形成噬菌體蛋白 +DNA +DNA 注入 +DNA 指導(dǎo)合成 M13外殼蛋白 轉(zhuǎn)錄 翻譯 mRNA 復(fù)制 +DNA 200個(gè) RF DNA DNA （每個(gè)細(xì)胞可釋放約 1000個(gè) M13顆粒） 組裝成子代 M13 M13基因組中只有基因 II和 IV之間存在一段507bp的 基因間隔區(qū) (