【正文】 的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢 。 質粒能利用寄主細胞的 DNA復制系統(tǒng) ，進行自主復制 。 The genomic DNA of : a single circular doublestranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell plasmid DNA Genomic DNA 4） 絕大多數(shù)的天然 DNA質粒具有共價 、 閉合 、 環(huán)狀的雙鏈結構(covalently closed circular DNA, cccDNA)， 以超螺旋形式存在 。 運送外源基因高效轉入受體細胞； 為外源基因提供復制能力或整合能力； 載體應具備的條件： 具有針對受體細胞的親緣性或親和性 (可轉移性 )； 具有合適的篩選標記。 質粒與宿主細胞的關系： 質粒對宿主的生存不是必需的 ， 只是 “ 友好 ”的 “ 借居 ” 宿主細胞中 。 10200拷貝 /cell， 復制不受細胞核控制 ，染色體 DNA復制停止時 ， 仍可進行復制 。 2） 非接合型質粒： 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用 ，如 ColE1質粒 。 RTF: resistance trarnsfer factor Col質粒： 大腸桿菌素質粒 ， 帶有控制大腸桿菌素合成的基因 ， 合成大腸桿菌素 ， 殺死不含Col質粒的親緣細菌 。 ColE1的篩選標志是大腸桿菌素 E1， 唯一的克隆位點 EcoR I正好位于這個基因內部 。 1） 抗生素抗性 基因： 3） 在選擇標記基因內 ， 引入人工合成的多種限制酶連續(xù)酶切位點的 DNA短序列 ， 即 多克隆位點(multiple cloning sites, MCS)， 也稱多酶接頭(polylinker)。 如： pBR322： pBR322 4,363 bp ori ROP ROI Sal I BamH I Tet r Pvu I Pst I EcoR I Cla I Hind III Hind II Bal I Amp r Pst I 松弛復制型 拷貝數(shù) 50100/cell 含 Ampr、 Tetr p: plasmid； BR: 取自構建者 ； 322: 實驗室編號 。 ori GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT EcoR I Sst I Kpn I Sma I Xba I Sal I Pst I Sph I Hind III 拷貝數(shù) 20223000/cell 用于基因克隆和測序 多克隆位點 MCS 正選擇顏色標記 lacZ’ University of California的 oriPBR32 AmprPBR322 pUC18/19正選擇標記 lacZ’的顯色原理 : pUC18/19 Plac lacZ’ MCS ? OHHHOHHO HH O HCH 2 OHONClBr底物： 5溴 4氯 3吲哚基 ?D半乳糖苷 （ Xgal） ?半乳糖苷酶 ?亞基 ? 誘導物：異丙基硫代半乳糖苷 （ IPTG） ClBrClBrONN5溴 4氯靛藍 （ ?互補） 整合質粒： 含整合酶編碼基因和整合特異性位點序列 ， 克隆在這種質粒上的外源基因進入受體細胞后 ， 能準確整合在受體細胞染色體 DNA的特定位點 。 探針質粒： 用于 篩選表達調控元件 ， 如啟動子 、 終止子 。 ?DNA兩端各有 12個核苷酸組成的 5’突出粘性末端 (cohensiveend)， 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ ?DNA 二者的核苷酸 序列互補， 進入宿主細胞后 ， 粘性末端連接成環(huán)狀 DNA分子 ， 此末端稱為 cos位點 (cohensiveend site)。 整合由 ?DNA上 cI和 int基因的產物激活 ，這兩個基因的開放與關閉又取決于宿主細胞本身的性質 。 縮短野生型 ?DNA長度 ， 可提高裝載量 。 限制酶酶切； 非必需區(qū)： 必需區(qū)： 加裝選擇標記 野 生型 ?DNA上缺少合適的選擇標記。 將野生型 ?DNA上 D和 E兩個頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG。 M13單鏈噬菌體 DNA 生物結構： 外型呈絲狀； 由外殼包裝蛋白和單股正鏈 DNA組成； 基因組為 單鏈線性 DNA，長 kb； DNA上至少有 10個基因，均為增殖所必需。 考斯質粒和噬菌粒的構建就是為了進一步提高噬菌體 DNA的裝載量。 ? 噬菌粒（ phagemid） 是一類人工構建的含 單鏈噬菌體 包裝序列 、 復制子和 質粒 復制子 、 克隆位點 、標記基因的特殊類型載體 。 當大片段外源 DNA克隆在人工染色體載體上 ， 便形成重組人工染色體 ， 它能像天然染色體那樣 ， 在受體細胞中穩(wěn)定復制并遺傳 。 。 裝載量大，為 300 kb； BAC的特點： 單拷貝復制； 可以像提取質粒一樣直接提取克隆的 DNA。 通過克隆雙鏈 DNA，能獲得同等長度的單一單鏈DNA； 重要的噬菌粒載體 pUC118/119 = pUC18/19的 ori、 Ampr、 lacZ’、 MCS + M13IG、 ori 3200 bp MCS lacZ’ lacI ori Ampr M13IG pUC118/119 pUC118/119： 1）雙鏈質粒復制模式 在宿主細胞沒有感染上 M13輔助噬菌體時 ， 受 pUC本身的復制起點控制 ， 每個細胞能達 500個拷貝 。 在包裝上限固定的條件下 ， 大幅度縮短噬菌體 DNA的長度 ， 就能同步增加載體的裝載能力 。 組裝成新的噬菌體 M13，擠出寄主細胞 M13通過雄性細菌的 F性須注入其 +DNA +DNA合成 DNA，形成雙鏈 RF DNA 復制 +DNA，轉錄 mRNA、翻譯形成噬菌體蛋白 +DNA +DNA 注入 +DNA 指導合成 M13外殼蛋白 轉錄 翻譯 mRNA 復制 +DNA 200個 RF DNA DNA （每個細胞可釋放約 1000個 M13顆粒） 組裝成子代 M13 M13基因組中只有基因 II和 IV之間存在一段507bp的 基因間隔區(qū) (