基因工程7克隆基因的表達(dá)概述(文件)
【正文】 ?半乳糖苷酶或 ?內(nèi)酰氨酶的基因相連接的方法 ， 構(gòu)建成雜合基因 。 提高克隆基因表達(dá)效率的途徑之一 ， 是增加相應(yīng)的 mRNA分子的數(shù)量 。 如果細(xì)菌由于突變而失去了重組質(zhì)粒 、 或無(wú)法表達(dá)重組質(zhì)粒 、 或質(zhì)?？截悢?shù)大大降低 ， 那么這樣的突變體菌株便會(huì)有很高的生長(zhǎng)速度 ， 迅速成為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢(shì)菌株；而具有重組質(zhì)粒的寄主細(xì)胞 ，最終會(huì)被 “ 稀釋 ” 掉 ， 使克隆基因無(wú)法得到表達(dá) 。 盡管 pBR322質(zhì)粒仍然是高拷貝數(shù)的 ， 而且產(chǎn)生無(wú)質(zhì)粒細(xì)胞的幾率也極小 ，但在某些特定條件下 ， 如營(yíng)養(yǎng)缺乏或是寄主細(xì)胞快速生長(zhǎng)期間 ， 也有可能產(chǎn)生出無(wú)質(zhì)粒的細(xì)胞 。 把外源基因連接到信號(hào)肽序列后面的多克隆位點(diǎn)上 ， 這樣表達(dá)產(chǎn)物就可以直接分泌到胞外 。 2023/4/12023/4/12023/4/1Apr231Apr23 ? 1故人江海別，幾度隔山川。 2023年 4月 2023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 ? 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 2023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 8:19:09 PM ? 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 2023年 4月 1日星期六 2023/4/12023/4/12023/4/1 ? 1楚塞三湘接，荊門(mén)九派通。 2023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 閱讀一切好書(shū)如同和過(guò)去最杰出的人談話(huà)。勝人者有力，自勝者強(qiáng)。 2023/4/12023/4/1April 1, 2023 ? 1一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。 2023年 4月 1日星期六 2023/4/12023/4/12023/4/1 ? 1最具挑戰(zhàn)性的挑戰(zhàn)莫過(guò)于提升自我。 2023/4/12023/4/12023/4/1Apr231Apr23 ? 1越是無(wú)能的人，越喜歡挑剔別人的錯(cuò)兒。 2023/4/12023/4/1April 1, 2023 ? 1空山新雨后，天氣晚來(lái)秋。 2023/4/12023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 1不知香積寺，數(shù)里入云峰。 2023/4/12023/4/12023/4/12023/4/1 ? 沒(méi)有失敗，只有暫時(shí)停止成功！。 2023/4/12023/4/12023/4/12023/4/14/1/2023 ? 1他鄉(xiāng)生白發(fā)，舊國(guó)見(jiàn)青山。 2023/4/12023/4/1Saturday, April 1, 2023 ? 雨中黃葉樹(shù)，燈下白頭人。 2. 若待表達(dá)的基因是化學(xué)合成的 ， 應(yīng)盡可能選擇大腸桿菌所偏愛(ài)的密碼子； 3. 使用不同的大腸桿菌宿主菌株 ， 有時(shí)可以收到意外的效果； 4. 優(yōu)化基因工程菌的培養(yǎng)條件； 5. 防止表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主菌的毒害作用 ， 及時(shí)將產(chǎn)物運(yùn)到胞外可減少毒害 。 天然質(zhì)粒具有一段分配功能區(qū) par， 能保證質(zhì)粒分子在每次細(xì)胞周期中都能準(zhǔn)確地進(jìn)行分離 ， 并均等地分配到子代細(xì)胞中去 。 對(duì)于第一種情況 ， 可采用強(qiáng)啟動(dòng)子；對(duì)于第二種情況 ， 可將基因克隆到高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體上 。在適當(dāng)?shù)目寺∥稽c(diǎn)插入 DNA片段 ， 即可產(chǎn)生由 DNA片段編碼的并有 ?半乳糖苷酶活性的融合蛋白 。 融合蛋白要比多數(shù)大腸桿菌的菌體蛋白大 ， 因此在蛋白質(zhì)凝膠電泳中易于鑒定 。 該融合蛋白包括位于氨基端的原核蛋白（ 通常為 ?半乳糖苷酶或 ?內(nèi)酰氨酶的一部分 ） ， 能被蛋白酶或溴化氰裂解的特殊序列 ，以及目的蛋白 （ 多肽 ） 。 而細(xì)菌細(xì)胞中沒(méi)有這一過(guò)程 ， 這就可能造成克隆基因在細(xì)菌中合成的功能蛋白不具有與原來(lái)完全相同的生物活性 。 (5) 直接位于起始密碼子 AUG左側(cè)的堿基三聯(lián)體的組成 ， 對(duì)轉(zhuǎn)譯效率也有重要影響 ， 以 ?半乳糖苷酶 mRNA的轉(zhuǎn)譯為例 ， 三聯(lián)體為UAU或 CUU時(shí) ， 轉(zhuǎn)譯最有效 ， 而若為 UUC或UCA時(shí) ， 則轉(zhuǎn)譯水平下降 20倍 。 2. 影響 mRNA轉(zhuǎn)譯效果的因素： (1) SD序列與反 SD序列的互補(bǔ)程度：互補(bǔ)程度高 ， 則表達(dá)強(qiáng) 。 真核生物的起始密碼子總是 AUG， 并轉(zhuǎn)譯為甲硫氨酸
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