【文章內容簡介】 Khanna et al.， 2022），以及青蒿 AaBBX22 （高爾娣 等， 2022）聚為 1組；另外，除了含 Bbox盒還有兩個典型的 C2H2結構域的擬南芥 AtAZF2 （ Sakamoto et al.， 2022），位于離 PhBBX8最遠的分支中，單獨聚為 1組。 Cheng和 Wang（ 2022）報道， AtBBX8 （ AtCOL10 ）與其高度相似的 AtBBX7 （ AtCOL9 ）在擬南 芥的開花調控上起著一個抑制因子的作用；在大豆中， GmCOL4 表達主要受生物節(jié)律 的影響，受光 的調節(jié)作用較弱，且主要在大豆葉片中表達（張清哲 等， 2022）； OsBBX25 受鹽、干旱和 ABA誘 導表達，異源表達 OsBBX25 的轉基因擬南芥與野生型相比對鹽和干旱的耐受性增強（劉焱 等， 2022）； AaBBX22 可能參與青蒿的耐鹽和耐旱調控（高爾娣 等， 2022）； AtAZF2 受干旱、高鹽、 ABA的誘導（ Sakamoto et al.， 2022）。 圖 3 PhBBX8與其它物種中 Bbox型鋅指蛋白的系統(tǒng)發(fā)生樹分析 Fig. 3 Phylogeic tree analyses of PhBBX8 and Bboxtype zincfinger proteins in other species PhBBX8 的組織表達模式分析 以矮牽牛不同組織（根、莖、葉和花）的 cDNA為模板進行 PCR擴增。結果（圖 4）顯 示， PhBBX8 在不同組織中的表達強弱依次為 花、根、莖、葉。 圖 4 PhBBX8 在矮牽牛不同組織中的表達 Fig. 4 Expression of PhBBX8 in various petunia tissues PhBBX8 的非生物逆境誘導表達分析 為了研究矮牽牛 PhBBX8 對非生物逆境脅 迫的應答，采用實時熒光定量 PCR技術分析其 在低溫、干旱、 ABA、 MeJA、高鹽和高滲處理下表達水平的變化。結果（圖 5）表明，在不同非生 物逆境脅迫下， PhBBX8 的表達水平呈現(xiàn)相似的變化趨勢。 低溫脅迫下， PhBBX8 在處理中后期，即處理 12 h表達水平有所上調，約為對照的 ，隨 后在后期 48 h表達量顯著增加，約為對照的 。干旱脅迫相較其他處理，對 PhBBX8 的表達量 2442 園 藝 學 報 41卷 影響較弱，從中期 6 h到 12 h表現(xiàn)為遞增，并在 12 h達到峰值，此后上調趨勢表現(xiàn)為遞減。 PhBBX8 顯著受到 ABA誘導，在中期，即處理 6 h，表達水平為未處理時的 34倍左右，并在中后期 12 h達 到峰值，約為對照的 90倍，而后迅速下降，幾乎與未處理時表達水平一致。 MeJA脅迫、高鹽脅迫 以及高滲脅迫下， PhBBX8 在葉中表達趨勢和 ABA脅迫下幾乎一致，僅表達量上調倍數(shù)有差異，但 表達水平均高于對照。 以上結果表明 PhBBX8 在植物逆境脅迫處理的中期階段其表達水平才逐漸產生變化，推測在植 物感受逆境之后 PhBBX8 在中后期參與到植物的逆境應答反應。 PhBBX8 作為轉錄因子，可能直接 或間接參與了植物逆境應答反應中下游基因的轉錄調控。另外， PhBBX8 同時在多種脅迫條件下的 表達水平變化趨勢較一致，似乎表明它在植物不同逆境應答途徑的交叉現(xiàn)象中發(fā)揮作用。 圖 5 非生物逆 境脅迫下 PhBBX8 的誘導表達分析 Fig. 5 Induced expression analysis of PhBBX8 under different abiotic stresses 3 討論 本研究中利用矮牽?；虮磉_譜芯片篩選出應答低溫脅迫的關鍵基因，從中發(fā)現(xiàn) 1個含 Bbox 盒的鋅指蛋白基因 PhBBX8 ，分離獲得該基因對應的矮牽牛全長 cDNA。通過氨基酸序列保守結構 域分析表明，矮牽牛 PhBBX8 基因 N端含有 2個 Bbox鋅指蛋白結構域， C端含有 1個 CCT結構 域（圖 2）。在擬南芥中 Bbox類鋅指蛋白分為 3個亞家族，其中最大的 1個亞家族包括 17個基因， 這些基因在其 C端的氨基酸序列中都含有 CCT（ CO， COlike， TOC1）結構域。 STO ， STH1 ， STH2 12期 寧露云等：矮牽牛 Bbox型鋅指蛋白基因 PhBBX8 的克隆與表達分析 2443 等以及另外 5個基因組成第 2個亞家族，它們在 N端含有 2個高度同源的 Bbox結構域。第 3個亞 家族只有 5個基因，它們在 N端只有 1個 Bbox結 構域（ Griffiths et al.， 2022； Datta et al.， 2022）。 根據(jù)矮牽牛 PhBBX8 的氨基酸序列特征分析，認為 PhBBX8 與擬南芥 Bbox類鋅指蛋白中第一個亞 家族關系更為緊密。 Cheng和 Wang（ 2022）研究表明，超量表達 AtCOL9 的擬南芥轉基因植株中， CO 和 FT 基因的表達水平降低從而表現(xiàn)出延遲開花。 AtCOL9 有 4個外顯子（長度分別為 52 17 292和 128 bp）和 3個內含子（長度分別為 10 93和 96 bp）。本試驗尚未對 PhBBX8 的基因組 DNA 序列做進一步的分析，在后續(xù)試驗中將對 PhBBX8 的外顯子和內含子進行探討，探討 PhBBX8 是否 由于序列結構上的差異而在功能上表現(xiàn)出與其它基因（如 AtCOL9 ）的不同。 前人的研究表明，不同的表達部位在一定程度與其功能有相關性。如高爾娣等（ 2022）的研究 結果顯示 AaBBX22 基因在青蒿根中表達量最高，而在莖、葉、初期花蕾、后期花蕾和花中表達量較 低，鹽和干旱處理都能顯著誘導該基因的表達，推測該基因可能參與青蒿的耐鹽和耐旱調控。盡管 大豆中的 GmCOL11 基因 在不同組織器官中有組成性表達，但在不同發(fā)育階段各器官中的表達也不 盡相同，在花期的根、莖、葉、花中表達量較低，莢中隨著莢的發(fā)育逐漸降低，在開花期復葉中表 達量較高，尤其在開花期第 3復葉中表達量達到峰值，推斷 GmCOL11 可能與開花調控有關（馬錦 花， 2022； Jiang et al.， 2022）。本研究中的 PhBBX8 基因在矮牽?；ㄖ械谋磉_量最高，其次為根， 而在莖和葉中的表達較弱。在不同非生物脅迫處理后發(fā)現(xiàn)， PhBBX8 在葉中的表達水平相較對照上 調倍數(shù)極高，對各脅迫在處理中期 6 h表現(xiàn)出極強 的響應。但是就 PhBBX8 基因在不同脅迫處理下， 在不同組織中的表達情況還值得進一步研究。 目前對植物 Bbox型鋅指蛋白的研究，如擬南芥（ Griffiths et al.， 2022； Cheng amp。 Wang， 2022； Kumagai et al.， 2022； Khanna et al.， 2022），水稻（ Nemoto et al.， 2022； Kim et al.， 2022； Huang et al.， 2022）等模式植物，油菜（艾育芳， 2022），大豆（張清哲 等， 2022）等農作物，以及高羊茅 （ 王小利 等， 2022），小立碗蘚（ Zobell et al.， 2022）等園藝植物主要集中在開花調控，花發(fā)育， 光形態(tài)發(fā)生以及光周期調控等方面，而在逆境脅迫方面的研究報道較少。 Lippuner等（ 1996）利用 酵母鈣神經蛋白突變體對鹽敏感的表型，從擬南芥 cDNA文庫中篩選到的 STO 基因（ AtBBX24 ），除 了可以互補酵母的鹽敏感表型之外，還可以互補酵母與鈣神經蛋白缺陷相關的表型。 AtSTO （ AtBBX24 ）的表達可以互補鈣調磷酸酶缺失突變體酵母的功能。 Nagaoka和 Takano（ 2022）的研究 結果表明，盡管 AtSTO 不受高鹽脅迫誘導，但在擬南芥中超量表達后能提高轉基因植株的耐鹽性。 此外， Indorf等（ 2022）利用 TDNA插入突變，超量表達以及 RNAi基因敲除等方法研究 AtSTO 的其 它未知功能，結果表明 AtSTO 在光信號傳導過程中有重要作用。 Huang等（ 2022）通過綜合生物信息 學分析從水稻中鑒定出 30個 BBX基因，除了 OsBBX1 、 OsBBX14 和 OsBBX19 基因，大部分 BBX基因 都有響應激素的順式元件，據(jù)此推斷這些基因可能有激素調節(jié)作用。有 29個 BBX基因至少含有一 個脅迫響應順式元件（ ARE、 Wbox、 GCmotif、 BoxW HSE或 MBS），表明這些基因可能在生 物脅迫以及非生脅迫響應中起作用。劉焱等（ 2022）對水稻中一個編碼含有 Bbox鋅指結構域蛋白的 OsBBX25 基因進行了功能分析，結果表明 OsBBX25 受鹽、干旱和 ABA誘導表達。異源表達 OsBBX25 的轉基因擬南芥與野生型相比對鹽和干旱的耐受性增強，且在鹽脅迫條件下轉基因植物中 KIN1 、 RD29A 和 COR15 的表達上調，干旱脅迫下 KlNl 、 RD29A 和 RD22 的表達上調。從而推測 OsBBX25 可 能作為轉錄調控的輔助因子調節(jié)脅迫應答相關基因的表達，進而參與植物對非生物脅迫的響應。青 蒿 AaBBX22 基因在鹽和干旱處理都能顯著被誘導表達， ABA、