【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 病毒，主要引起人或動(dòng)物皮膚粘膜的增生性病變。對(duì)于乳頭瘤病毒最早的認(rèn)識(shí)始于20世紀(jì)初，當(dāng)時(shí)的研究發(fā)現(xiàn)，一些含有人或動(dòng)物疣組織成分的無(wú)菌濾過(guò)液可以傳播疣。但是在此后較長(zhǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，對(duì)于乳頭瘤病毒的研究并未引起廣泛的興趣。其主要原因是乳頭瘤病毒難以在組織中培養(yǎng)，限制了對(duì)其生活周期，致病機(jī)理等方面的深入研究，而且人乳頭瘤病毒被認(rèn)為只引起良性病變，其醫(yī)學(xué)意義有限。不過(guò)在這期間，通過(guò)對(duì)棉尾兔動(dòng)物模型的研究也逐漸積累關(guān)于PV病毒感染機(jī)制，生活周期的大量資料。隨著20世紀(jì)70年代分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)于PV的認(rèn)識(shí)不斷深入，其與人類疾病的關(guān)系也不斷被揭示：在1981年和1983年，引起人生殖器粘膜疣的HPV6, HPV11分別被發(fā)現(xiàn)[1, 2]；zur Hausen在1983和1984年成功地從宮頸癌組織中分離出HPV16和HPV18病毒株[3, 4]，從而闡明了某些型別HPV感染與宮頸癌發(fā)生的密切關(guān)系。這一發(fā)現(xiàn)使得HPV的研究引起了前所未有的重視，更多的研究者進(jìn)入了HPV研究領(lǐng)域，大量的研究資金也源源不斷得投入這一領(lǐng)域，使得該領(lǐng)域有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。而zur Hausen也因?yàn)檫@項(xiàng)突破性的發(fā)現(xiàn)獲得了2008年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。1991 年，F(xiàn)razer等人發(fā)現(xiàn)，在體外表達(dá)HPV L1蛋白在特定條件下可以自發(fā)形成與病毒顆粒結(jié)構(gòu)高度一致的類病毒顆粒（Viruslike particle，VLP），這種類病毒顆粒具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，是一種理想的HPV疫苗形式。該發(fā)現(xiàn)標(biāo)志著HPV研究從理論積累進(jìn)入了應(yīng)用開(kāi)發(fā)的全新領(lǐng)域[5]。2006年，世界上第一種HPV疫苗Gardasil的上市標(biāo)志HPV研究上的又一里程碑式的突破。預(yù)計(jì)在今后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，HPV的研究應(yīng)然是病毒學(xué)研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。2. HPV的結(jié)構(gòu). HPV基因組結(jié)構(gòu)HPV的基因組是大小約為8kb雙鏈DNA，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。其基因組可以分為含有大部分的順式作用元件，控制早期、晚期基因的表達(dá)和病毒組裝的長(zhǎng)控制區(qū)（long control region，LCR）；編碼早期非結(jié)構(gòu)蛋白（E1E8）的早期開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF）和編碼晚期衣殼蛋白（L1和L2）的晚期開(kāi)放ORF。所有這些ORF均位于同一條DNA鏈上，HPV基因組所編碼各蛋白的功能見(jiàn)表1。圖 1：HPV16基因組結(jié)構(gòu)圖[6]Fig. 1: Scheme of HPV genomic structure. HPV的早期蛋白表 1 ：HPV各蛋白的功能[6]Tab. 1: Functions of different proteins expressed by HPV基因表達(dá)時(shí)期細(xì)胞定位/數(shù)量基因表達(dá)產(chǎn)物功能L1晚期細(xì)胞核/++++主要衣殼蛋白，L2晚期細(xì)胞核/++次要衣殼蛋白，輔助DNA包裝E1早期細(xì)胞核/+輔助游離體復(fù)制，DNA解旋酶E2早期細(xì)胞核/+轉(zhuǎn)錄因子，參與病毒基因組復(fù)制E3早期？？E4晚期細(xì)胞質(zhì)/+++輔助病毒包裝E5早期細(xì)胞質(zhì)/+抑制細(xì)胞分化E6中期細(xì)胞核/+抑制細(xì)胞分化促進(jìn)P53降解E7中期細(xì)胞核/++阻止細(xì)胞生長(zhǎng)停頓/分化，降低E2F抑制因子的活性E8早期？？早期蛋白產(chǎn)生于病毒感染的早期，主要調(diào)控病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)換功能。E1和E2蛋白在人角朊細(xì)胞內(nèi)以附加體的形式存在，共同調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，為啟動(dòng)病毒復(fù)制所必需。E1是一個(gè)六聚體的解螺旋酶，與細(xì)胞的DNA解螺旋酶具有功能和結(jié)構(gòu)的同源性，能在LCR內(nèi)的E1依賴性的復(fù)制起始位點(diǎn)（E1 ori）處結(jié)合DNA聚合酶α和伸展的DNA，對(duì)于早期的病毒基因組復(fù)制和基因組在基底上皮層中的維持極為重要[7]。E2蛋白能調(diào)節(jié)HPV蛋白的表達(dá)，也能增加HPV基因組的遺傳穩(wěn)定性，還作為E6和E7的轉(zhuǎn)錄抑制子與LCR作用。如果病毒基因組整合到宿主染色體上后丟失E2基因，對(duì)E6和E7的負(fù)調(diào)控就會(huì)終止，將促進(jìn)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。但是目前對(duì)于E1,E2的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，可能受細(xì)胞的分化狀體調(diào)控[8, 9]。E4蛋白的功能目前尚不十分清楚，但是有研究表明，該蛋白可能與病毒顆粒的釋放有關(guān)。EE6和E7三者編碼基因均為病毒癌基因，在病毒的生活周期中共同起著重要的作用[10]。其中，E6蛋白有151個(gè)氨基酸組成，分子量約為18kD。該蛋白的主要結(jié)構(gòu)為兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)是CysXXCys，為所有HPV型別E6蛋白所共有。E6蛋白轉(zhuǎn)化細(xì)胞的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，可以通過(guò)多個(gè)細(xì)胞通路對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性進(jìn)行調(diào)解從而導(dǎo)致細(xì)胞永生化。但是，目前研究最深入也是最重要的一條途徑就是促進(jìn)抑癌蛋白P53的降解。E6蛋白可以通過(guò)C末端結(jié)合P53蛋白，從而促進(jìn)泛素連接酶E3p，E6相關(guān)蛋白（E6AP）對(duì)P53蛋白的降解。在上述過(guò)程中，E6蛋白與P53的結(jié)合是其發(fā)揮功能的關(guān)鍵。致癌型與非致癌型HPV的E6蛋白在性質(zhì)上的差異主要體現(xiàn)在其與P53的結(jié)合活性上[11]。E6蛋白除了可以直接促進(jìn)P53蛋白降解之外，還可以使得P53蛋白滯留于胞漿，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，從而抑制P53的正常功能。E7蛋白由98個(gè)氨基酸組成，分子量約為18kD，是HPV的重要轉(zhuǎn)化蛋白。在E7蛋白上，具有一段序列為L(zhǎng)XCXE的保守結(jié)合域。通過(guò)該區(qū)域，E7蛋白能夠與與pRB家族蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞進(jìn)入S期。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，E7蛋白可以激活鈣離子依賴蛋白酶，直接降解pRB[12]。E5蛋白是一種具有疏水特性的膜結(jié)合蛋白，與E6，E7蛋白失活負(fù)性細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子不同，其通過(guò)上調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的活性而發(fā)揮作用[13]。E5與E6,E7蛋白一起，在病毒的生活周期中共同發(fā)揮重要作用，并且E5蛋白對(duì)于E6/E7蛋白的致癌活性也有增強(qiáng)作用。目前，有多種證據(jù)證表明，高危型HPV E6/E7蛋白可以協(xié)同作用滅活多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，使得細(xì)胞生長(zhǎng)失去正常調(diào)控。這被認(rèn)為是HPV感染是引發(fā)癌癥的主要原因。HPV E6/E7蛋白蛋白協(xié)同致癌的詳細(xì)機(jī)制見(jiàn)圖2。此外，由于HPV E6/E7蛋白在發(fā)生癌變的細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，多種宮頸癌的治療性疫苗均以上述兩個(gè)蛋白作為靶分子[1416]。圖2E6，E7在宮頸癌形成中作用[11] The roles of E6, E7 in the development of cervical cancer. HPV晚期蛋白與病毒結(jié)構(gòu)圖3 HPV 顆粒電鏡圖 [17] TM of HPV virion人乳頭瘤病毒呈球形，為直徑約為5560nm的無(wú)包膜DNA病毒（見(jiàn)圖3）。其病毒衣殼由72個(gè)殼粒以T=7的20面體形式組裝而成。而每個(gè)殼粒都是由5個(gè)主要衣殼蛋白L1單體聚合而來(lái)。在72個(gè)殼粒中，有60個(gè)殼粒以六臨體的形式與其它殼粒相接，而另外12個(gè)殼粒以5臨體的形式與其他殼粒相接（見(jiàn)圖4）[17]。次要衣殼蛋白L2也與L1一起參與了病毒顆粒的組裝。HPV的基因組DNA與組蛋白結(jié)合，形成核小體，被包裹于病毒衣殼內(nèi)。在體外，多種表達(dá)系統(tǒng)來(lái)源的L1蛋白可以自發(fā)組成類病毒顆粒。該類病毒顆粒在形態(tài)上與天然病毒顆粒無(wú)異，保留了病毒顆粒的天然構(gòu)象，是進(jìn)行HPV相關(guān)研究的強(qiáng)有力工具，也是一種良好的HPV疫苗形式圖4 HPV顆粒的冷凍電鏡三維重建圖[17]Fig4. Threedimensional image reconstructions of a cryoEM analysis of virion particle structuresHPV的主要衣殼蛋白在病毒感染的晚期才開(kāi)始合成，因此也被稱為晚期蛋白L1。HPV L1蛋白大約有500個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為5560kD。同型別之間的L1序列保守，幾種常見(jiàn)型別的L1序列同源性均在60%以上。圖5 HPV16 L1結(jié)構(gòu)圖[18] Structure of HPV16 L12000年， Chen 16L1蛋白三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定，這項(xiàng)研究揭示了HPV L1蛋白功能和性質(zhì)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是HPVL1蛋白研究的一個(gè)重大突破[18]。Chen 的研究表明，HPV16 L1的三級(jí)結(jié)構(gòu)核心組成是由20 – 382氨基酸殘基所組成的一個(gè)典型的“果凍卷”狀β折疊桶（如圖5所示）。圖中所示各個(gè)字母B到I表示β折疊桶中的各個(gè)片段，CHEF4個(gè)片段與BIDG4個(gè)片段分別組成了該結(jié)構(gòu)中反向平行的兩個(gè)片層，在各個(gè)片段之間有BC、CD、DE、EF、FG和HI環(huán)狀連接肽連接。其中的DE，F(xiàn)G，HI三個(gè)連接肽具有較大的柔性，明顯突出于β折疊桶的外表面，是HPV L1蛋白抗原表位的主要分布區(qū)域。圖6 T=1的HPV16 VLP結(jié)構(gòu)圖[19] The structure of HPV16 VLP (T=1)圖7 T=7的HPV16 VLP結(jié)構(gòu)圖[19] The structure of HPV16 VLP(T=7)此外，在HPV L1中還存在h1 h5 5個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)。在β折疊桶的C端，是由383476位氨基酸所組成的α螺旋區(qū)域，該結(jié)構(gòu)從所在的五聚體伸出。HPV16 L1蛋白476505位氨基酸在T=1的“小”VLP中是以“折返臂”的模式存在：該結(jié)構(gòu)重新折返，返回所在的五聚體，折返產(chǎn)生的突出末端與相鄰的兩個(gè)五聚體的相應(yīng)部位相結(jié)合（見(jiàn)圖6）。在T=7的HPV顆粒中，HPV16 L1蛋白476505位氨基酸并不折返，而是直接插入相鄰的五聚體中。而后， 428Cys與相對(duì)應(yīng)的L1蛋白上的175Cys形成二硫鍵，連接兩個(gè)五聚體，這就是所謂的“侵入臂”模式（見(jiàn)圖7）[19, 20]。此外，該部分結(jié)構(gòu)為堿性氨基酸的富集區(qū)域，可能具有結(jié)合病毒DNA的能力[21]。在五聚體內(nèi)部，各個(gè)L1蛋白單體緊密接觸。例如，BIDG片層的G片段能夠與相鄰單體的CHEF片層相接觸。而表面的各個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域之間也存在密切接觸，例如，HI環(huán)能夠順時(shí)針插入相鄰單體的FG與EF之間[18]。. 二硫鍵與HPV 顆粒結(jié)構(gòu)Doorbar 等發(fā)現(xiàn)從病變組織分離而來(lái)的HPV顆粒是由二硫鍵交聯(lián)而形成的[22]，隨后Sapp 等發(fā)現(xiàn)DTT會(huì)破壞HPV VLPs結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致顆粒崩解為五聚體[23]。此外的研究進(jìn)一步表明，在體外利用氧化劑促進(jìn)半胱氨酸之間二硫鍵的形成將會(huì)促進(jìn)五聚體組裝為顆粒[24]。上述研究結(jié)果無(wú)一例外的都證明了二硫鍵在HPV顆粒形成當(dāng)中的重要作用。圖8 乳頭瘤病毒L1蛋白氨基酸序列比對(duì)（僅顯示Cys）[25] Alignment of L1 amino acid sequences of papillomaviruses（show Cys only）通過(guò)多個(gè)型別HPV L1蛋白序列的比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，L1上Cys具有高度的保守性。特別在某些重要位置上，例如427位Cys，不僅僅是在HPVL1蛋白上高度保守，而且在BPV,CRPV L1蛋白上也呈現(xiàn)高度保守性（見(jiàn)圖8）。通過(guò)對(duì)HPV16L1蛋白上的Cys進(jìn)行突變研究可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Cys427被突變之后，HPV16 L1只能組成五聚體，無(wú)法進(jìn)一步組裝成為顆粒，這說(shuō)明該半胱氨酸參與了五聚體之間的交聯(lián)。Cys175，185則被認(rèn)為通過(guò)與其他L1蛋白形成二硫鍵參與了L1蛋白的二聚化以及三聚化，進(jìn)而幫助L1蛋白形成五聚體。而Cys161，229，379通過(guò)分子內(nèi)的二硫鍵維持L1蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定[25]。 . L1蛋白的自組裝多種表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的HPV L1蛋白能夠在特定的條件下自組裝成為VLP[5, 2628]。如上所述，L1蛋白中的二硫鍵在VLP的形成中起到重要作用，VLP的形成伴隨著二硫鍵正確配對(duì)。因此，L1蛋白自組裝的一個(gè)重要條件是局部氧化環(huán)境的形成。利用去除溶液中還原劑，添加適當(dāng)?shù)难趸瘎┑确椒ǘ伎梢源龠M(jìn)L1蛋白的組裝[29]。此外，pH值以及離子強(qiáng)度對(duì)于L1蛋白的自組裝也有重要的作用，例如有研究表明，較低的pH值（67）有助于VLP的形成，而隨著pH的升高，VLP組裝效率不斷下降，則大部分VLP都會(huì)受到破壞。鹽濃度的升高對(duì)于L1的組裝有明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)溶液中的鹽濃度高達(dá)1M時(shí)，即使溶液中存在還原劑，L1蛋白依然能夠形成VLP[30, 31]。L1蛋白本身的截短情況也對(duì)于自組裝特性有著很大的影響。此前的研究表明，當(dāng)L1蛋白的C末端截短不超過(guò)30個(gè)氨基酸時(shí)，不會(huì)對(duì)其組裝為VLP產(chǎn)生影響。但是當(dāng)截短超過(guò)30個(gè)氨基酸時(shí)，L1蛋白只能組裝成為五聚體，而無(wú)法進(jìn)一步組裝成為VLP[32]。而在HPV16 L1中，當(dāng)N端缺失不超過(guò)10個(gè)氨基酸時(shí)，不會(huì)對(duì)顆粒的組裝產(chǎn)生影響，但是當(dāng)N端缺失超過(guò)10個(gè)氨基酸時(shí)，L1蛋白只能組成含有12個(gè)五聚體的T=1的“小”VLP[24]。. 表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)與表位通過(guò)對(duì)多個(gè)型別HPV L1蛋白氨基酸序列的比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，所有的序列高變區(qū)均位于五聚體外表面上的環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域（圖9）。這些高變區(qū)很有可能是HPV血清型的分子基礎(chǔ)或者是組織特異性的基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)多株HPV 中和單抗的定位可以發(fā)現(xiàn)，所有的中和單抗結(jié)合位點(diǎn)均位于上述的幾個(gè)高變區(qū)內(nèi)（圖8）[3339]。這些環(huán)狀結(jié)構(gòu)區(qū)域在五聚體的表面形成了一系列復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)成了HPV的主要中和表位，而且這些表位往是由多個(gè)相距較遠(yuǎn)的環(huán)狀區(qū)域通過(guò)復(fù)雜的折疊相互接近而形成。一旦上述構(gòu)象被破壞，這些中和表位也隨之消失。因此，只有天然構(gòu)象的L1蛋白才能誘導(dǎo)出具有中和活性的抗體，這一點(diǎn)對(duì)HPV預(yù)防性疫苗的開(kāi)發(fā)至關(guān)重要[28, 40]。HPV主要表位具有型特異性，這些特異性的分子基礎(chǔ)也存在于不同型別HPV L1表面環(huán)結(jié)構(gòu)的細(xì)微差別上[34]。能識(shí)別多個(gè)HPV型別的交叉反應(yīng)抗體基本上都是線性的而且不具有中和活性，雖然有研究發(fā)現(xiàn)，存在一些能夠同時(shí)中和多個(gè)不同型別HPV的單抗，但是這些單抗的中和滴度明顯較低。可能原因是這些單抗在結(jié)合特異性中和表位部分區(qū)域的同時(shí)也結(jié)合了該表位附近的非特異性位點(diǎn)，使得其阻斷病毒感染的能力下降[41]。圖9 HPV11,HPV16,HPV18及HPV35 L1蛋白的序列比對(duì)[34] Sequence alignment of L1 from the HPV