【文章內(nèi)容簡介】 mRNA 混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達 ， 其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長 ， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時間就相應增加 ， 外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域 ， 如選擇性標 記基因和復制子結(jié)構(gòu)等 ， 則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復制及其 它生物功能 ， 甚至導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mRNA 往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì) ， 增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴重的是 ， 過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu) ， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 強終止子的選擇與使用 目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子 核糖體結(jié)合位點 外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于 轉(zhuǎn)錄啟動的頻 率 ，而且在很大程度上還與 mRNA 的 翻譯起始效率 密切相關(guān)。 大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5‘ 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為 核糖體結(jié)合位點（ RBS） 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 6–8 個核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ 即 ShineDalgarno（ SD） 序列 ， 它通過識別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3’ 端區(qū)域 3’ AUUCCUCC 5’ 并與之專一性結(jié)合 將 mRNA 定位于核糖體上 ， 從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子 ， 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點 ， 有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD 序列的影響 一般來說， mRNA 與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就 越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD （ UAAGGAGG） 序列與 16S rRNA 的堿基互補性，其中以 GGAG 四個堿基序列尤為重要。 對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成 C 或 T，均會導 致翻譯效率大幅度降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD 序列與起始密碼子之間的序列的影響 SD 序列下游的堿基若為 AAAA 或 UUUU， 翻譯效率最高；而 CCCC 或 GGGG 的翻譯效率則分別是最高值的 50% 和 25%。 緊鄰 AUG 的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響 。 對于大腸桿菌 b半乳糖苷酶的 mRNA 而言 ， 在這個位置上最佳 的堿基組合是 UAU 或 CUU， 如果用 UUC、 UCA 或 AGG 取代 之 ， 則酶的表達水平低 20 倍 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 SD 序列與起始密碼子之間的距離的影響 SD 序列與起始密碼子 AUG 之間的精確距離保證了 mRNA 在 核糖體上定位后 ， 翻譯起始密碼子 AUG 正好處于核糖體復合物 結(jié)構(gòu)中的 P 位 ， 這是翻譯啟動的前提條件 。 在很多情況下 ， SD 序列位于 AUG 之前大約七個堿基處 ， 在此 間隔中少一個堿基或多一個堿基 ， 均會導致翻譯起始效率不同 程度的降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 大腸桿菌中的起始 tRNA 分子可以同時識別 AUG、 GUG 和 UUG 三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG 為 AUG 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 除此之外，從 AUG 開始的前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)重要，至 少這一序列不能與 mRNA 的 5’ 端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便 會嚴重干擾 mRNA 在核糖體上的準確定位 目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與 啟動子來源相同的核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳的。 核糖體結(jié)合位點 不同的生物 ， 甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因 ， 對簡并密碼子使用頻率并不相同 ， 具有一定的偏愛性 ， 其決定因素是： 生物基因組中的堿基含量 在富含 AT 的生物 （ 如單鏈 DNA噬菌體 φX174） 基因組中 ， 密碼子 第三位上的 U 和 A 出現(xiàn)的頻率較高； 在 GC 豐富的生物 （ 如鏈霉菌 ） 基因組中 ， 第三位上含有 G 或 C 的 簡并密碼子占 90% 以上的絕對優(yōu)勢 密碼子與反密碼子相互作用的自由能 性中等強度規(guī)律 如 GGG、 CCC、 GCG、 GGC、 AAA、 UUU、 AUA、 UAU 等使用少 如 GUG、 CAC、 UCG、 AGC、 ACA、 UGU、 AUC、 UUG 等使用多 細胞內(nèi) tRNA 的含量 密碼子 生物體對密碼子的偏愛性 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達的影響 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中 高效翻譯 的一個重要因素是密碼子的正確選擇。 一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達： 外源基因全合成 同步表達相關(guān) tRNA 編碼基因 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響 目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝 ， 質(zhì)粒的擴增 過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi) ，而此時正是 細菌生理代謝 最旺盛的階段 。 質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝 ， 進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入 可控制 的軌道 外源基因在大腸桿菌中的表達 蛋白質(zhì)的合成是在細胞之中進行的 目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是： 表達質(zhì)粒的構(gòu)建比較簡單； 能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的 20%～ 40%。 目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有二種： 在細胞內(nèi)表現(xiàn)為不溶性的包涵體顆粒 包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中 在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì) 可溶性的目標蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借助于本身的 功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分泌到周質(zhì)空 間，或外泌到培養(yǎng)液中。 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 包涵體型異源蛋白的表達 分泌型異源蛋白的表達 融合型異源蛋白的表達 寡聚型異源蛋白的表達 整合型異源蛋白的表達 蛋白酶抗性或缺陷型表達系統(tǒng)的構(gòu)建 外源基因在大腸桿菌中的表達 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種 水不溶性 的結(jié)構(gòu)稱為 包涵體 （ Inclusion Bodies， IB）。 富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。 由高效表達質(zhì)粒構(gòu)建的大腸桿菌工程菌大量合成非天然性的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。 除此之外，包涵體中還含有少量的 DNA、 RNA和脂多糖等非蛋白分子 包涵體型異源蛋白的表達 以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達形式的優(yōu)點 在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 能夠避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集 簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作 包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌 體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細 菌裂解物中分離出來 能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白 。 包涵體型異源蛋白的表達 以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點 包涵體表達形式的缺點 以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過