大腸桿菌基因工程(1)(編輯修改稿)
2025-06-24 01:42 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 P 乳糖啟動子 Plac O P O 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 誘導 乳糖 異丙基 bD硫代半乳糖苷（ IPTG） 野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac 偶聯(lián)在一起，在沒有誘導物 存在時，整個操縱子處于基 基底水平轉(zhuǎn)錄 底水平表達；誘導物可以使 啟動子 Plac介導的轉(zhuǎn)錄大幅 提高 lacI 負調(diào)控 轉(zhuǎn)錄受 CAP 正調(diào)控和 lacI 負調(diào)控 P 乳糖啟動子 Plac O P O 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 誘導 乳糖 異丙基 bD硫代半乳糖苷（ IPTG） 野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac 偶聯(lián)在一起，在沒有誘導物 存在時，整個操縱子處于基 基底水平轉(zhuǎn)錄 底水平表達；誘導物可以使 啟動子 Plac介導的轉(zhuǎn)錄大幅 提高 轉(zhuǎn)錄受 CAP 正調(diào)控和 lacI 負調(diào)控 lacI 負調(diào)控 P 乳糖啟動子 Plac O P O 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 誘導 乳糖 異丙基 bD硫代半乳糖苷（ IPTG） 野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac 偶聯(lián)在一起，在沒有誘導物 存在時，整個操縱子處于基 高水平轉(zhuǎn)錄 底水平表達；誘導物可以使 啟動子 Plac介導的轉(zhuǎn)錄大幅 提高 轉(zhuǎn)錄受 CAP 正調(diào)控和 lacI 負調(diào)控 lacI 負調(diào)控 P 乳糖啟動子 Plac O 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 誘導 乳糖 異丙基 bD硫代半乳糖苷（ IPTG） 野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac 偶聯(lián)在一起，在沒有誘導物 存在時，整個操縱子處于基 底水平表達；誘導物可以使 啟動子 Plac介導的轉(zhuǎn)錄大幅 提高 轉(zhuǎn)錄受 CAP 正調(diào)控和 lacI 負調(diào)控 lacI 負調(diào)控 問題 1： 葡萄糖是宿主最適碳源，而啟動子受葡萄糖阻遏， 不便于發(fā)酵培養(yǎng)基設計 對策： 采用突變型 Plac UV5（不受葡萄糖阻遏） Plac lacI 調(diào)控模式的問題與策略 Plac CAP正調(diào)控 O Plac O 高效轉(zhuǎn)錄 葡萄糖代謝 野生型的 Plac上游附近擁有 代謝激活蛋白（ CAP） 結合 區(qū)， cAMP激活 CAP， CAP 基底水平轉(zhuǎn)錄 結合啟動子控制區(qū)，進而促 進 Plac介導的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖 代謝使 cAMP減少，也能阻 遏 Plac介導的轉(zhuǎn)錄。因此， 可采用突變手段構建抗葡萄糖代謝阻遏的 突變型， 即 Plac UV5 CAP cAMP cAMP濃度降低 Plac UV5 O 高效轉(zhuǎn)錄 突變型乳糖啟動子 Plac UV5 問題 2 乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作為誘導劑 對策 采用 “ 安慰誘導劑 ” IPTG（不被降解和代謝） Plac lacI 調(diào)控模式的問題與策略 IPTG：異丙基 D硫代半乳糖苷 (isopropylβ D thio galactoside) 問題 3： 宿主 lacI 阻遏蛋白表達量不高，無法滿足多拷貝質(zhì)粒的需求， 導致較高的本底表達（即無誘導表達） 對策 A、采用能過量表達 lacI 阻遏蛋白的 lacI q 突變菌株 B、在 載體上引入 lacI q 基因 Plac lacI 調(diào)控模式的問題與策略 啟動子 Ptrp 色氨酸啟動子（ Ptrp） Otrp 除去 色氨酸 色氨酸啟動子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸 基底水平轉(zhuǎn)錄 或者加入 3吲哚丙烯酸（ IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。 在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去 色氨酸是困難的，因此基因工程 中往往添加 IAA誘導 Ptrp介導的目 基因的表達 色氨酸 或加 3吲哚丙烯酸 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 （ IAA） Otrp Ptrp 高效轉(zhuǎn)錄 Otrp Ptrp ? 受 lacI 阻遏蛋白調(diào)控 雜合型啟動子 Ptac ? Ptac = Ptrp 的 35區(qū) + Plac的
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