蛋白質(zhì)的表達(dá)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-31 12:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶 IPTG 誘導(dǎo) T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 溫度誘導(dǎo)型 PL 啟動子控制 T7 RNA 聚合 酶基因 ， 通過熱誘導(dǎo)方式激發(fā) T7 噬菌體啟動子的轉(zhuǎn)錄 。 這種方式可以使本底轉(zhuǎn)錄降到 很低的水平 ， 尤其適用于表達(dá) 對大腸桿菌宿主有毒性的重組 蛋白質(zhì) 。 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動子 （ CE6） T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶 熱誘導(dǎo) cI857 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 雙質(zhì)粒系統(tǒng) 一個質(zhì)粒帶有 T7 RNA 聚合酶 基因 ， 另一個質(zhì)粒帶有 T7 啟 動子和目的基因 兩個質(zhì)粒的復(fù)制子和抗性標(biāo)記 不能相同 調(diào)控方式為控制 T7 RNA 聚合 酶的啟動子調(diào)控類型 T7 RNA 聚合酶 熱誘導(dǎo) T7 啟動子 目的基因 T7 RNA 聚合酶基因 PL 啟動子 cI857 p15A ori KanR ColE1 ori AmpR The Terminator ? ?? Stops RNA synthesis at specific points along the DNA template ? ?? The enzyme stops polymerising nucleotides into RNA, releases the RNA chain and leaves the DNA to eventually reinitiate at another promoter. ? ?? Features: A dyad symmetry in the DNA, centered 15 to 20 nucleotides before the end of the RNA this leads to a transcript that can form an hairpin loop Run of about six As in the DNA template which are transcribed into Us at the end of the RNA How could these two structural features cause termination? 強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強啟動子的控制下表達(dá) ， 容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象 ， 即 RNA 聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA 序列 ， 形成長短不一的 mRNA 混合物 。過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá) ， 其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長 ， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA 所需的時間就相應(yīng)增加 ， 外源基 因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域 ， 如選擇性標(biāo) 記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等 ， 則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其 它生物功能 ， 甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mRNA 往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì) ， 增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是 ， 過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu) ， 從而大大降低外 源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 強終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA 操縱子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌體 DNA 上的 Tf。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特 殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子 核糖體結(jié)合位點 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于 轉(zhuǎn)錄啟動的頻 率 ，而且在很大程度上還與 mRNA 的 翻譯起始效率 密切相關(guān)。 大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。 mRNA 翻譯的起始效率主要由其 5? 端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為 核糖體結(jié)合位點（ RBS） 核糖體結(jié)合位點 大腸桿菌核糖體結(jié)合位點包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素： 位于翻譯起始密碼子上游的 6–8 個核苷酸序列 5‘ UAAGGAGG 3‘ 即 ShineDalgarno（ SD） 序列 ， 它通過識別大腸桿菌核糖體小亞 基中的 16S rRNA 3‘ 端區(qū)域 3‘ AUUCCUCC 5‘ 并與之專一性結(jié)合 將 mRNA 定位于核糖體上 ， 從而啟動翻譯； 翻譯起始密碼子 ， 大腸桿菌絕大部分基因以 AUG作為閱讀框架的 起始位點 ， 有些基因也使用 GUG 或 UUG 作為翻譯起始密碼子 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 基因編碼區(qū) 5‘ 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點 ? 面面俱到 Novagen ? 因為純化愛上你 GE（原安瑪西亞） ? 更快克隆 Invitrogen 面面俱到 Novagen 面面俱到 Novagen ? 是否要用基因本身的起始密碼子進(jìn)行選擇 ? 是否要可溶性表達(dá)，選擇加有不同標(biāo)記的載體 ? 你希望用藍(lán)白斑篩選可以使用 pETBlue系列載體 ? 除了傳統(tǒng)的酶切、連接方式外，還有不需要連接的克隆方式 ? Novagen提供 菌株種類 多種菌株 :BL21 , Rosetta ,Origami ? 除了常用培養(yǎng)基 LB、 TB、 M M9ZB 等：可以直接進(jìn)行過夜培養(yǎng)培養(yǎng)基 Overnight Express? Autoinduction System ? Novagen還有表達(dá)雙外源蛋白的載體 pCDFDuet1 DNA 、pETDuet? 1 DNA 、 pRSFDuet1 DNA ：最多可以同時表達(dá) 8個外源蛋白 ? 有許多不同系列的載體、菌株供選擇；與原核表達(dá)的各種相關(guān)產(chǎn)品都一應(yīng)俱全 ：載體、菌株、培養(yǎng)基、檢測表達(dá)的抗體、純化產(chǎn)品 抗性和標(biāo)簽 ? BL21 :lon, ompT ? BL21(DE3) : T7 polymerase ? Rosetta: optimal codons ? Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione reductase (gor) ? Rosettagami ? Origami B: (IPTG concentration dependent) 菌株種類 菌株種類 ? 蛋白酶缺陷型 都是 lon蛋白酶和 ompT蛋白酶缺陷型，這包括有 BL21, Origami? , Rosetta? ?？梢员３值鞍椎姆€(wěn)定不被降解。 ? 保證所
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