人白蛋白重組表達(dá)的最新研究進(jìn)展-ppt(編輯修改稿)
2025-03-26 16:19 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 以甘油為碳源積累生物量的生長(zhǎng)期和以甲醇為碳源的 rHSA 誘導(dǎo)表達(dá)期。 ? 甲醇的流加速率控制在培養(yǎng)基中的濃度小于 1 % , 一般誘導(dǎo)表達(dá) 150～ 300h 左右。整個(gè)過(guò)程的 pH 控制在 610 左右 , 溶氧控制在 10 %以上。 ? 在兩段法的發(fā)酵條件優(yōu)化方面 , 發(fā)現(xiàn)將甘油和甲醇混合流加可提高 rHSA 產(chǎn)量 , 也就是誘導(dǎo)開(kāi)始時(shí)首先流加甲醇 , 在確保醇氧化酶被誘導(dǎo)后 , 開(kāi)始混合流加?；旌狭骷訒r(shí)嚴(yán)格控制甘油和甲醇的度比例和流加速率 , 使發(fā)酵液中甘油不積累 , 同時(shí)甲醇濃度不超過(guò) %。 20230401 19 影響酵母表達(dá)外源蛋白的因素 ? 外源基因特性 ? 主要涉及外源基因 mRNA 5′端非翻譯區(qū)、 A + T 組成和密碼子的使用頻率 ? 外源基因拷貝數(shù)和穩(wěn)定性 ? 釀酒酵母和一些其他的酵母有多拷貝的內(nèi)源質(zhì)粒是建成高拷貝表達(dá)載體基礎(chǔ)?？寺∥稽c(diǎn)影響外源基因表達(dá)的高效穩(wěn)定。 ? 一般情況下 ,畢赤甲醇酵母中外源基因整合的拷貝數(shù)愈高 ,則蛋白表達(dá)量愈大。 20230401 20 影響酵母表達(dá)外源蛋白的因素 ? 表達(dá)條件的優(yōu)化 ? 表達(dá)條件的優(yōu)化主要包括通氣量、培養(yǎng)基、搖菌密度、蛋白酶、誘導(dǎo)劑的含量等。 ? 充足的通氣量對(duì)于誘導(dǎo)階段外源蛋白的表達(dá)是極其重要的。 有報(bào)道認(rèn)為 , 如果用發(fā)酵罐進(jìn)行培養(yǎng) , 外源蛋白的表達(dá)水平要比普通搖瓶發(fā)酵高出10～ 100 倍。 ? 通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基的 p H 值 ,在培養(yǎng)基中添加 1 %酪氨酸蛋白水解物等措施來(lái)抑制蛋白酶活性 ,使降解程度減至最低。此外選用蛋白酶缺陷的受體菌是減弱蛋白酶作用的有效方法 ? 誘導(dǎo)期間培養(yǎng)基中定期補(bǔ)充誘導(dǎo)劑 ,對(duì)于誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白十分重要。如對(duì)于畢赤甲醇酵母誘導(dǎo)期間培養(yǎng)基中每天應(yīng)補(bǔ)加甲醇 ,以彌補(bǔ)甲醇的消耗和蒸發(fā)。 ? 誘導(dǎo)時(shí)間也是影響外源蛋白表達(dá)量的重要因素 , 誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短表達(dá)量低 , 誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則外源蛋白降解增加 20230401 21 提高表達(dá)的一些策略 ? 啟動(dòng)子：最近在巴斯德畢赤酵母中克隆到的一個(gè)組成型三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子 PGAG ,在它的控制下 β LabZ 基因表達(dá)率比甲醇誘導(dǎo)下 PAOX1 驅(qū)動(dòng)的產(chǎn)量更高 ,由于該組成型啟動(dòng)子不需要甲醇誘導(dǎo) ,發(fā)酵工藝更簡(jiǎn)單 ,同時(shí)其產(chǎn)量更高 ,所以成為代替 PAOX1最有潛力的啟動(dòng)子。 ? 整合位點(diǎn)：酵母核糖體 RNA 的基因 rDNA 在染色體中具有100～ 200 個(gè)重復(fù) ,是提高外源基因拷貝數(shù)的最佳整合位點(diǎn)之一。 ? 宿主菌選擇：根據(jù)利用甲醇的能力不同 , 巴斯德畢赤酵母菌分為 Mut+ 、 Muts 和 Mut 3種表型。蛋白酶缺失的宿主菌可減少表達(dá)蛋白的酶解消化 , 有利于外源蛋白的穩(wěn)定。 ? 信號(hào)肽修飾：信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的改變 (如突變、修飾、融合等 ) 可能會(huì)提高分泌效率。有研究發(fā)現(xiàn)，改造了的信號(hào)肽大大提高了外源蛋白表達(dá)量。 20230401 22 降解控制 ? 改造 P. pastoris 表達(dá)宿主菌株 , 缺失基因組中主要蛋白水解酶的基因 , 使目的基因穩(wěn)定。 ? 在培養(yǎng)液中補(bǔ)加一些富含氨基酸的組分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物 , 或在培養(yǎng)基中加入 YP (酵母提取物 + 蛋白胨 ) , 提供給酵母細(xì)胞蛋白酶過(guò)量的底物 , 以減少目的蛋白的降解 ? 加入蛋白酶抑制劑 ? 畢赤酵母在非緩沖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表達(dá) , 將 pH 降到 3 或更低 , 使得許多中性 pH 蛋白酶失活 ? 共表達(dá)蛋白酶抑制物來(lái)抑制蛋白酶活性 , 減少目的蛋白降解 ? 將目的蛋白連上一個(gè)過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)使其被分揀轉(zhuǎn)運(yùn)入過(guò)氧化物酶體貯存起來(lái) , 免受蛋白酶降解 , 還可減少對(duì)宿主細(xì)胞的毒害作用 20230401 23 重組人血清白蛋白在漢遜酵母中的表達(dá)與純化 ? 漢遜酵母同巴斯德畢赤酵母一樣均是甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母，有相似的特性 ? 二者啟動(dòng)子類型、外源基因整合方式、甲醇代謝途徑關(guān)鍵酶基因的調(diào)控機(jī)制、篩選標(biāo)記等方面存在差異 ? 漢遜酵母重組菌遺傳性質(zhì)穩(wěn)定、表達(dá)量和分泌效率高、適合于大規(guī)模發(fā)酵，是當(dāng)前國(guó)際上公認(rèn)的最為理想的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一 ? 國(guó)內(nèi)大連漢信生物制藥生產(chǎn)的漢遜酵母重組乙肝疫苗自2023年投放市場(chǎng)由于其更高的抗體水平、更高的陽(yáng)轉(zhuǎn)率、更高的母嬰阻斷率而備受市場(chǎng)青睞 20230401 24 重組人血清白蛋白在漢遜
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