【文章內(nèi)容簡介】 Waston—Crick堿基配對與細胞內(nèi)核酸 (DNA或認 )特異結(jié)合形成雜交分子，從而在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制特定基因表達的技術(shù)。 ?反義寡聚核苷酸 (ASO)技術(shù)是用單鏈 RNA 或 DNA 來改變 mRNA的新陳代謝從而調(diào)節(jié)從基因到蛋白質(zhì)的信息。 ?ASO可結(jié)臺到靶基因上而不影響其它基因， 這一特點使得 ASO 成為了解蛋白質(zhì)生物功能的一個有利工具。 ?反義 RNA比反義 DNA長得多， 而且有不止一個結(jié)合位點， 可能還會產(chǎn)生非專一性序列的作用 反義 DNA在細胞液中更穩(wěn)定嶼，但它的作用是瞬時的。 義寡核苷酸類藥物的機制 ? 反義寡核苷酸與靶 mRNA結(jié)合形成 DNARNA雜合分子，可以激活 RNase H，該酶可以切割雜合分子中的 RNA鏈，導(dǎo)致靶 mRNA降解。 ? 不能激活 RNase H活性的反義寡核苷酸可以通過空間位阻效應(yīng)阻止核糖體結(jié)合來抑制靶 mRNA的翻譯 ? ASODN的作用是在 DNA結(jié)合蛋白（如甲基化酶、激活子、限制性內(nèi)切酶等）的識別位點處，通過與靶基因結(jié)合形成三螺旋，并且位點專一性地干擾 DNA和蛋白的結(jié)合、激活子的轉(zhuǎn)錄起始或轉(zhuǎn)錄延伸等，進而阻止基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。 ? 可以通過封閉剪接位點，從而糾正錯誤的剪接。 反義寡核苷酸技術(shù)應(yīng)用 ?l967年就提出了利用與轉(zhuǎn)錄 RNA互補的寡聚核苷酸來調(diào)節(jié)基因表達的設(shè)想 ?1978年在體外研究勞氏肉瘤病毒基因特定位點的抑制時， 此設(shè)想才得到證實 (Zameik等， 1978)。 ?在人類骨髓細胞的白血病細胞系 HL一 60中由載體產(chǎn)生的 ASO結(jié)合到 c—myc先導(dǎo)序列的單鏈片斷上使得 c—myc的轉(zhuǎn)錄水平降低。 c—myc轉(zhuǎn)錄的降低遣成 HL6O細胞中單核白血球不同且抑制了它的繁殖速度。 ?為人類疾病在基因水平進行治療的戰(zhàn)略手段。 目前，已有近 10種抗腫瘤反義藥物已經(jīng)完成了實驗研究，正在進行 IⅢ 期臨床實驗 . ASODN的作用特點是 ： ? (1)縮短新藥的研發(fā)周期，降低新藥的研發(fā)成本。 ? (2)具有高度的特異性。 ASODN是疾病蛋白基因為靶點，針對疾病蛋白表達的某一特定過程進行阻斷，因此具有高度特異性。 ? (3)在真核細胞中具有內(nèi)源性。 AS0DN的給藥系統(tǒng) ? 脂質(zhì)體載體 ? 脂質(zhì)乳制劑 ? 納米球及微球載體 ? 樹枝狀高聚物 ? 凝膠制劑 ASODN改性 ? 1） ASODN的化學(xué)改性作用，通過 ASODN進行化學(xué)改性，如在 ASODN的 3′ 末端連接上化學(xué)切割試劑、乙二胺四乙酸、二價鐵離子或鄰菲羅琳的衍生物，在改性過程中需要銅離子和還原劑的存在，可實現(xiàn)對靶基因進行誘導(dǎo)切割等不可逆的反應(yīng)，從而導(dǎo)致靶基因的失活?？朔思毎麅?nèi)限制性內(nèi)切酶對未改性 ASODN的快速水解作用，延長了 ASODN在細胞內(nèi)的半衰期； ? 2） ASODN的 3′ 末端和 5′ 末端可以采用許多封端基因來改性。 反義核酸 ? 硫代磷酸酯寡核苷酸 第一代反義核酸 ? 雜合型反義核酸 第二代反義核酸 ? 肽核酸 第三代反義核酸。 硫代寡核苷酸 （ phosphorothioate oligonucleotides， SONs） ? SONs是比較成熟、應(yīng)用最廣泛的寡核苷酸。該結(jié)構(gòu)中磷酸二酯鍵的未結(jié)合氧原子被硫原子取代，可以提高對核酸酶的抗性。 ? 天然結(jié)構(gòu)的寡核苷酸（ phosˉphodiester oligonucleotides， POONs） 混合骨架寡核苷酸 （ mixedbackbone oligonucleotides， MBO） ? MBO是繼 SONs后的第二代寡核苷酸。 MBO在不同的位置上包含不同的修飾，通常由天然 DNA、含硫代磷酸酯的 DNA、 2′ O甲基 RNA和 2′ O烯丙基 RNA中的兩種或兩種以上組合而成。 2′ O甲基 RNA在MBO中的位置與 MBO的性質(zhì)密切相關(guān)，將它置于 3′或 5′ 端的修飾穩(wěn)定性顯著優(yōu)于 SONs 。 MBO減少了硫代磷酸二酯的數(shù)量，降低了由硫代引起的副效應(yīng)， 2′ O甲基 RNA/mRNA的雙鏈親和力增強，保留的硫代磷酸二酯鍵仍起到了抗核酸酶的作用。 肽核酸 (peptide nucleic acid， PNA) ? 是一種以中性酰胺鍵為骨架并兼有多肽和核酸性質(zhì)的獨特化合物，是一類新型的核酸類似物， ? 由于其獨特的理化性質(zhì)、雜交特性以及對基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控作用，在分子生物學(xué)研究、腫瘤和傳染性疾病基因治療等方面均顯示出較為廣闊的應(yīng)用前景 PNA的分子結(jié)構(gòu) ? PNA是由丹麥科學(xué)家 Nielsen于 1991年首先合 ? 成的，其經(jīng)典的分子結(jié)構(gòu)是由重復(fù)性的 N(2氨基乙基 )甘氨酸單元通過酰胺鍵相連取代 DNA分子中的磷酸二酯鍵骨架所形成的一種 DNA分子的類似物，其嘌呤和嘧啶堿基則通過亞甲基羰基連接在甘氨酸的氮原子上。 肽核酸 特點 （ peptide nucleic acids， PNA） ? 1. 與核酸的雜交能力強于核酸間的雜交能力； ? 2. 熱穩(wěn)定性高于核酸間的雜交體； ? 3. 抗酶解能力增強，由于其非肽和非核酸的結(jié)構(gòu)特點，蛋白酶和核酸酶均不能降解 PNA。 肽核酸 PNA的理化性質(zhì) ? PNA的結(jié)構(gòu)使其具有以下特點： ? ①對核酸具有特異性識別能力，因不帶電而避免了 PNA與陰性的 DNA或 RNA的靜電排斥； ? ②可用化學(xué)合成法在其 N末端或 C末端連上 PNA寡聚體、報告基團、金屬黏合劑及某些插入基團； ? ③具有高度生物穩(wěn)定性，不易被核酸酶、多肽酶及蛋白酶降解； ? ④ 無手性，無需對映體純化。 PNA具備了獨特的雜交性質(zhì)： (1)由于 PNA骨架結(jié)構(gòu)呈電中性，當其與互補的靶核酸序列交時不受靜電排斥作用的影響，所形成的 PNA—DNA或 PNARNA雜交分子比天然雜交分子具有更高穩(wěn)定性。 (2)PNA的另一雜交特性是雜活性幾乎不受介質(zhì)鹽濃度的影響，在低鹽濃度條件下， PNA與靶序列 DNA或 RNA雜交還有利于消除二級結(jié)構(gòu)對雜交效率的影響 。 (3)PNA 以序列特異性的方式與互補的 DNA 或 RNA分子雜交， PNA既可以采取反向平行互補結(jié)合方式，也可以采取正向平行互補結(jié)合方式與其靶序列雜交，但以反向平行互補結(jié)合方式為主 。 (4)PNADNA雜交比 DNA． DNA雜交更易受堿基錯配的影響，PNADNA堿基錯配雜交體分子的不穩(wěn)定性比 DNADNA堿基錯配雜交體分子的不穩(wěn)定性高 (3)PNA 以序列特異性的方式與互補的 DNA 或RNA分子雜交， PNA既可以采取反向平行互補結(jié)合方式，也可以采取正向平行互補結(jié)合方式與其靶序列雜交，但以反向平行互補結(jié)合方式為主 。 (4)PNADNA雜交比 DNA． DNA雜交更易受堿基錯配的影響， PNADNA堿基錯配雜交體分子的不穩(wěn)定性比 DNADNA堿基錯配雜交體分子的不穩(wěn)定性高 ? Gowers等通過實驗證實了 DNA三螺旋在含有很多嘧啶間隔的靶位點能形成并通過胞嘧啶的質(zhì)子化進行穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)三螺旋結(jié)構(gòu)具有這種功能，科學(xué)地研制出了一種對核酸酶的穩(wěn)定性和膜透性都有提高的新型 DNA模擬物肽核酸（ peptide nucleic acid. PNA）。 ? PNA與互補的 DNA或 RNA結(jié)合具有高度專一性，具備與靶基因形成二聚體的能力。 PNA對基因表達的調(diào)節(jié)作用 ? 1. PNA對轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)節(jié)作用 ? 2. PNA對翻譯過程的調(diào)節(jié)作用 ? PNA的應(yīng)用 ?PNA在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用 ?PNA在雜交技術(shù)中作為探針的應(yīng)用 ?PNA在 PCR技術(shù)中的應(yīng)用即 “ PCR夾 ” (PCR clamping ?PNA在核酸捕獲和基因分離中的應(yīng)用 ?PNA應(yīng)用于生物傳感器 ?PNA與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用 PNA在疾病診療中的應(yīng)用 ?PNA與疾病診斷基因探針及由其組成的基因芯片已被應(yīng)用于臨床。相應(yīng)的 PNA探針能夠消除靜電的排斥力，較易進入 DNA分子，構(gòu)建比較方便，且特異性、親和性比傳統(tǒng)的基因探針和基因芯片更強，因而診斷疾病的效果更佳 . ?PNA在疾病治療中的應(yīng)用 :PNA可作為反義、反基因藥物。關(guān)于 PNA的分布研究表明，除腦以外， PNA能快速輸送到所有組織，其血清半衰期為 6～ 10 min，靜脈半衰期大約為 10 min，從而實現(xiàn)了 PNA對疾病的治療作用 DNA的三級結(jié)構(gòu)與功能 DNA超螺旋 染色質(zhì)和核小體 DNA超螺旋 雙螺旋 DNA進一步扭曲盤繞則形成三級結(jié)構(gòu)， 超螺旋是 DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。 超螺旋分為正超螺旋和負超螺旋兩種。真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體時存在著負超螺旋。所有的 DNA超螺旋都是由 DNA拓撲異構(gòu)酶產(chǎn)生的。 自從 1965年 Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的環(huán)形 DNA的超螺旋以來，現(xiàn)知道絕大多數(shù)原核生物都是共價封閉環(huán)(covalently closed circle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu) (superhelix或supercoil)，真核染色體為線形分子 ,但其 DNA均與蛋白質(zhì)相結(jié)合，兩個結(jié)合點之間突環(huán) (loop)結(jié)構(gòu)類似于CCC分子，同樣具有超螺旋形式。 DNA超螺旋 超螺旋結(jié)構(gòu) DNA三級結(jié)構(gòu) 核小體 染 色 質(zhì) 染色質(zhì) DNA變性 融解溫度 (Tm,