人類胎盤促乳激素與人類促乳激素穿插嵌合重組蛋白(編輯修改稿)
2025-01-31 17:13 本頁面
【文章內容簡介】 sight II ? 將已選殖出之 hPRL receptor gene進行電腦模擬 ， 加上 PRL之模擬結果 ， 以得到兩蛋白質互相作用之模式 。 ? 模擬各 Shuffling gene之三級結構 ,比較其蛋白質結構 ， 並由模擬預測可能之功能性 ,如與 receptor之結合位置 。 工作項目及實施方法 5. Shuffling gene與 hPRL receptor之結合力試驗 ? Yeast twohybrid system是近年發(fā)展的蛋白質交互作用研究方法 。 – 以 yeast two hybrid 的方法，以 hPRL receptor為釣餌，找出與 hPRL receptor有交互作用的 Shuffling gene – hPRLR gene pGBKT7 vector – shuffling gene pGADT7 vector – yeast表現出轉錄活化之表型 ? 如 lacZ基因表現而使加入 Xgal培養(yǎng)之菌體產生藍色 ? Essential gene – 存 活 工作項目及實施方法 Shuffling gene與 hPRL receptor之結合力試驗 ?其利用將釣餌蛋白的基因剪接入一帶有 DNA binding domain基因之現載體 ， 以產生釣餌蛋白與 DNA binding domain之融合蛋白；另外候選之 library基因則剪接入一帶有轉錄活化因子基因之載體 ， 以產生候選蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白 ?當此兩種選殖載體均被轉型入酵母菌內 ， 若釣餌蛋白與候選蛋白產生交互作用 ， 則 DNA binding domain會與酵母菌內之DNA結合 ， 轉錄活化因子則促使標示基因表現 ， 如此則可以挑出可與釣餌蛋白質交互作用之候選蛋白質 。 工作項目及實施方法 6. Binding constant ? Yeast two hybrid： 定性 ? 藉由 ELISA方法測定重組蛋白質與接受體的結合常數。 – 另一個篩選的方法：可以將 shuffling的 protein點於晶片上，再利用帶有標示的 receptor protein，來將與hPLR有交互作用之蛋白質篩選出。 – 參考各文獻的方法，以 gel filtration 來分析與 hPRL receptor之競爭力。 ? 對 hPRL receptor有較大競爭力者，可能為抗乳癌藥物 candidate。 工作項目及實施方法 7. NMR/XRay蛋白質結構測定 ? 將與清華大學余靖教授合作進行 NMR測試 ? 與中研院袁小含博士合作進行 XRay測定重組蛋白質的分子結構。 工作項目及實施方法 8. Clinical studies ? 篩選出可能有功用之重組蛋白質後，將再以乳腺細胞株做 in vitro assay。 ? 以特定乳癌老鼠進行 animal model試驗。 9. hPL之細胞動素 (cytokine)變化 ? 乳腺細胞株與 hPL或重組蛋白共同培養(yǎng)之，測定 cytokine 如 IGF IL量之變化或其他 cytokine量之變化。 目前研究結果 1. DNA shuffling試驗 ? 先前的試驗，試以 不同濃度DNaseI與 不同作用時間 的搭配，尋找出可以適當剪切 DNA為不同大小片段的條件。 – 最後以以 DNase I剪切DNA，室溫作用 10分鐘，可得到較佳的剪切情況，最小片段可由電泳膠片上看出約 200bp。 200bp 目前研究結果 1. DNA shuffling試驗 ? 而在將 DNA片段重新組合的PCR試驗，則先以 Taq聚合脢做試驗，但卻無法正確生合成所要的 DNA。 ? 後經參考 paper上以辨識度較高的聚合脢做效果較好，則改以rTth聚合脢做重組的 PCR，則可得到重組的 DNA。 目前
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