dna的復(fù)制與重組課程(編輯修改稿)
2025-01-26 01:51 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 the loading of PCNA RFC is the functional homolog of the clamploader ? plex ??Polymerase switching occurs even on lagging strands。 pol ? does most of DNA synthesis 二， DNA的重組 第一節(jié) 概述 一、 DNA重組 （ rebination） 概念： DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生遺傳信息的重新組合，稱為遺傳重組（ geic rebination） ,或者基因重排 (gene rearrangement)。 意義：重組是遺傳學(xué)的靈魂，沒有重組就沒有生物的進(jìn)化；沒有重組也就沒有現(xiàn)代的分子克隆技術(shù) 二、 DNA重組的類型 同源重組 （ Homologous Rebination） 位點(diǎn)特異性重組 （ Sitespecific Rebination） DNA的轉(zhuǎn)座 （ transposition） 第二節(jié) 同源重組 一、概述 定義：兩個(gè) DNA分子同源序列之間進(jìn)行的重組 條件： （ 1）兩個(gè) DNA分子 有同源序列 （相關(guān)的酶可以用任何一對同源序列為底物） （ 2）兩個(gè) DNA分子 必須緊密接觸 發(fā)生： 真核生物 : 非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域。 原核生物 : 依賴 recA蛋白，并形成 Holliday 結(jié)構(gòu) Holiday模型 （ 1964年 ） 二、大腸桿菌同源重組的分子基礎(chǔ) （ 一 ） RecA 作用：可促進(jìn) 單鏈同化或單鏈吸收 RecA具有使 DNA單鏈置換雙鏈中同源鏈的能力 特異地識別單鏈 DNA， 并能將之與同源 DNA中的互補(bǔ)順序 “ 退火 ” ， 同時(shí)將另一條鏈排擠出去 （ 取代 ） ，形成雜種分子 單鏈同化發(fā)生的三個(gè)條件 （ 1）其中一個(gè) DNA必須存在單鏈區(qū) （ 2）其中一個(gè) DNA必須有一個(gè)自由 3’末端 （ 3）此單鏈區(qū)和 3’末端必須位于兩分子之間互補(bǔ)的區(qū)域內(nèi) （ 二 ） RecBCD復(fù)合體 酶的活性： （ 1） 核酸外切酶 （ 2） 核酸內(nèi)切酶 （ 3） 解旋酶 作用： 在 Chi位點(diǎn)處產(chǎn)生含3ˊ 游離未端單鏈 . （三） Chi位點(diǎn) RecBCD識別的靶位點(diǎn) 539。 GCTGGTGG 339。 339。 CGACCACC 539。 是重組頻率較高的部位 5~10 kb有一個(gè)拷貝， 斷裂和重連產(chǎn)生異源雙鏈 DNA 1. 同源序列排列在一起； 2. 酶切。通過核酸酶和 RecBCD蛋白復(fù)合體的作用在一對同源DNA上產(chǎn)生切口； 。含有 3’端切口的 ssDNA被recA蛋白包裹形成 recA蛋白 ssDNA細(xì)絲； RecAssDNA 細(xì)絲尋找相對的 DNA雙螺旋上的相應(yīng)序列。 三、 Holiday重組模型 4. 游離端交叉連接，形成Holliday 結(jié)構(gòu) 雙鏈 DNA。 十字形結(jié)構(gòu) 6. 空間重排。十字型兩臂旋轉(zhuǎn) 180度 7. 解離 (兩種不同方式 ) 8. 修補(bǔ)連接 附： 基因敲除 ( Gene knockout) 是 80年代后半期應(yīng)用 DNA同源重組 原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)是指對一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，或用其它順序相近基因取代，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測相應(yīng)基因的功能。 基因敲除的技術(shù)路線如下： （ 1）構(gòu)建重組基因載體 ﹔ （ 2）用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi) ,基因敲除的靶細(xì)胞目前最常用的是小鼠 ES細(xì)胞 （ 3）用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞 ﹔ （ 4）轉(zhuǎn)入假孕母鼠使其生長成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測。 四 細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組 3種形式： 1）轉(zhuǎn)化 2）轉(zhuǎn)導(dǎo)
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