dna重組培訓講義(編輯修改稿)
2025-01-26 02:14 本頁面
【文章內容簡介】 體與 Holliday位點結合的結構模型。 RecBCD 和 RecA 的共同作用 ? 單鏈侵入 Singlestrand uptake ? 鏈交換 Singlestrand assimilation 重組修復 在復制叉處重組水平的ＤＮＡ修復 第二節(jié) 位點特異性重組 ? 位點特異性重組 （ Sitespecific rebination）需要在特定的位點上發(fā)生斷裂和重接，從而產生精確的ＤＮＡ重排。 ? 位點特異性重組廣泛存在于各類細胞中，起著十分特殊的作用，彼此有很大的不同。它們的作用包括某些基因表達的調節(jié)、發(fā)育過程中程序性 DNA重排，以及有些病毒和質粒 DNA復制循環(huán)過程中發(fā)生的整合與切除等。此過程往往發(fā)生在一個特定的短（ 20～ 200bp） DNA序列內（重組位點），并且有特異的酶（重組酶）和輔助因子對其識別和作用。 位點特異性重組的結果決定于重組位點的位置和方向。如果重組位點以相反方向存在于同一 DNA分子上，重組結果發(fā)生倒位。重組位點以相同方向存在于同一 DNA分子上，重組發(fā)生切除；在不同分子上，重組發(fā)生整合 一、 λ噬菌體 DNA的整合與切除 ? λ噬菌體 DNA進入宿主大腸桿菌細胞后存在溶原和裂解兩條途徑，二者的最初過程是相同的，都要求早期基因的表達，為溶原和裂解途徑的歧化做好準備。兩種生活周期的選擇取決于 CI和 Cro蛋白相互拮抗的結果。 CI蛋白抑制除自身外所有噬菌體基因的轉錄，如果 CI蛋白占優(yōu)勢，溶原狀態(tài)就得到建立和維持。 Cro蛋白抑制 CI基因的轉錄，它占優(yōu)勢噬菌體即進入繁殖周期，并導致宿主細胞裂解。 λ噬菌體的整合發(fā)生在噬菌體和宿主染色體的特定位點，因此是一種特異位點重組。整合的原噬菌體隨宿主染色體一起復制并傳遞給后代。但在紫外線照射或升溫等因素誘導下，原噬菌體可被切除下來，進入裂解途徑，釋放出噬菌體顆粒。 整合和切除過程是在細菌 DNA和噬菌體 DNA專一性的附著位點(attachment site ,att)上進行的 ? 細菌的附著點稱att B,由序列 BOB’組成 ,噬菌體的附著位點稱 att P,由序列 POP’組成。 ? 其中 O序列是 att B和 att P所共有的，所以稱為核心序列（ core sequence) ? 重組后形成兩個新att位點， att L (BOP’ ) 和 att R (POB’ ) ? 位點專一性重組反應的定向特征取決于重組位點的識別。盡管整合和切除過程是可逆的，但反應導向則由不同條件決定的。 ? 整合過程要求在 att B和 att P之間進行識別 ,而切除過程則在 att L 和 att R之間識別 整合反應 ? λ噬菌體編碼一種酶 —λ整合酶 （ λ integrase, INT)， 它能切斷ＤＮＡ，并能使它重新連接．從而直接將噬菌體ＤＮＡ插入大腸桿菌染色體中，通過兩條ＤＮＡ的專一位點上的重組合并成一個環(huán)狀分子．整合作用需要由大腸桿菌編碼的整合宿主因子 ＩＨＦ（ integration host factor） 的共同作用． 模型說明 att P和 att B部位進行了交叉斷裂，互補單鏈末端進行交叉雜交。 λDNA交換點之間的距離為 7bp， ? 在位點專一性重組中，有關蛋白質結合在 att部位的特定位點上。 ? 當 INT和 IHF蛋白結合在 att P位點時形成的復合物稱為整合體（ intasome）。整合體就是捕獲 att B的中間體。 ? INT蛋白分子可能作為整合體的一部分結合到 att B 的核心位點上，說明 att P和 att B的最初識別不是直接取決于 DNA的同源性，而是由 INT蛋白識別兩個 att序列的能力來決定的，當需要鏈交換反應時，同源序列在此階段才顯得重要。 切除反應（ excision） ? 當誘發(fā)原噬菌體生長時，整合作用發(fā)生逆轉，這個過程稱為切除 （ excise） 。 ? 切除需要 Xis蛋白，它抑制整合作用。 ? INT， XIS， IHF連在一起覆蓋了全部att P，從而不利于進行整合反應。 ? 當噬菌體進入溶源狀態(tài)時優(yōu)先發(fā)生整合反應。而當噬菌體進入裂解周期時則切除反應占優(yōu)勢，通過控制 INT和 XIS的存量發(fā)生適當
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