dna重組技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-26 01:53 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 粒 為 載 體 的 DNA 克 隆 過 程 目 錄 目 錄 一、 DNA克隆的核心過程是構(gòu)建重組DNA分子 （一）構(gòu)建重組載體產(chǎn)生 DNA雜合分子 目 錄 1. 根據(jù)目的選擇適宜的克隆策略 2. 通過限制性內(nèi)切酶水解載體及外源片段產(chǎn)生配伍末端 （ 1）限制酶水解載體使成為線性分子 （ 2）根據(jù)目的選擇外源 DNA的來源 （ 3）限制性內(nèi)切酶水解外源 DNA片段以產(chǎn)生與載體配伍的末端 目 錄 3． DNA連接酶將載體 DNA與外源 DNA連接 (1) 粘端連接 (2) 平端連接 (3) 同聚物加尾連接 (4) 人工接頭 (linker)連接 目 錄 Bam HⅠ 切割反應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGATCCGGATCCG載體 DNA用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CG重組體 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CGGCC TAGCC TAGA TC CGGA TC CG載體自連 目的基因自連 同一限制酶切位點(diǎn)(單酶切)連接 目 錄 不同限制酶切位點(diǎn) (雙酶切 )的連接 GAATT CCT TAAG AGA TCTTC TAGAEco RⅠ 切割位點(diǎn) GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTABg lⅡ 切割位點(diǎn) AATTC GATC TAGA ATTCGGATCTAAATTC G ATC TAG+ EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAT4 DNA連接酶 15℃ 重組體 配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。 目 錄 目 錄 平端連接 適用于： 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端 目 錄 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶 15℃ 重組體 載體自連 目的基因 自連 目 錄 目 錄 同聚物加尾連接 在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase)的作用下 ， 在 DNA片段末端加上同聚物序列 、 制造出粘性末端 ， 再進(jìn)行粘端連接 。 目 錄 5? 3? 3? 5? 載體 DNA 5? 3? 3? 5? 目的基因 限制酶或機(jī)械剪切 限制酶 5? 3? 3? 5? 5? 3? 3? 5? λ核酸外切酶 λ核酸外切酶 5? 3?T(T)nT T(T)nT 3? 5? 5? 3?A(A)nA A(A)nA 3? 5? 末端轉(zhuǎn)移酶 + dATP 末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T4 DNA連接酶 15℃ 重組體 目 錄 目 錄 人工接頭 (linker)連接 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接 。 目 錄 人工接頭及其應(yīng)用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5? 3? Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 目 錄 目 錄 （二）重組分子可通過擴(kuò)增、篩選與分離鑒定而獲得 1. 將重組 DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和感染幾種方法 ① 將外源 DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌的過程稱 轉(zhuǎn)化 (transformation) ② 將外源 DNA直接轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞的過程稱 轉(zhuǎn)染 (transfection) ③ 采用包裝病毒將外源 DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的過程稱 感染 (infection) 目 錄 2．標(biāo)志篩選和序列分析可用于重組子的篩選和鑒定 （ 1）質(zhì)粒的抗性基因是轉(zhuǎn)化菌的篩選標(biāo)志 （ 2）用插入失活篩選重組子 （ 3）標(biāo)志補(bǔ)救 (marker rescue)是篩選轉(zhuǎn)化酵母的常用方法 （ 4）限制性圖譜和核酸序列分析可直接鑒定外源 DNA 目 錄 (插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇 目 錄 目 錄 α互補(bǔ) pBR322 目 錄 α互補(bǔ)的檢測(cè) 目 錄 組氨酸缺陷 型大腸桿菌 無組氨酸 的培養(yǎng)基 酵母咪唑甘油磷 酸脫水酶基因 促進(jìn)組氨酸合成 λDNA 重組體 標(biāo)志補(bǔ)救 目 錄 目 錄 二 、利用重組 DNA技術(shù)可分離、克隆單個(gè)基因 （ 一 ） 候選基因有染色體 DNA和 cDNA兩種來源 待克隆 DNA的來源可以是染色體 DNA， 也可以是cDNA。 這需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)
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