dna重組質(zhì)粒的構(gòu)建概述(文件)
【正文】 要 S甲硫氨酸腺苷的存在。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的 4核苷酸的酶切位點(diǎn)，即 Bfa Ⅰ （ C`TAG) 的酶切位點(diǎn)。同裂酶限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下 ,也能切割一些與其特異識(shí)別序列類似的序列。建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng) 通常， 10個(gè)單位的內(nèi)切酶可以切割 1μg不同來(lái)源和純度的 DNA。比如，酶切 1ug lambdaDNA，需要 12單位的酶，而酶切 1ug質(zhì)粒 DNA，需要 35單位的酶。突出端），也可以是平端的片段。 DNA 待切割的 DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、 EDTA、去污劑或過(guò)多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。不需要 BSA的酶如果加了 BSA也不會(huì)受太大影響 反應(yīng)體積 內(nèi)切酶活力單位的定義是： 1小時(shí)內(nèi)， 50μl反應(yīng)體積中，降解 1μg的底物 DNA所需的酶為一個(gè)活力單位。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。如果加入的酶較多，可以相應(yīng)地縮短反應(yīng)時(shí)間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長(zhǎng)時(shí)間以使反應(yīng)達(dá)到完全終止反應(yīng) 如果不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來(lái)終止反應(yīng)。此外，酚 /氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。 BSA不能與 Buffer混合后保存，否則將會(huì)出現(xiàn) BSA沉淀1穩(wěn)定性 大部分酶在推薦的保存緩沖液里在 20℃ 條件下十分穩(wěn)定。如果有抑制劑存在（通常是鹽、 EDTA或酚），則混合物里的對(duì)照DNA也無(wú)法被切開使用限制性內(nèi)切酶的一般步驟A）測(cè)試酶切 DNA的量B）計(jì)算完全酶切所需的酶量。加入水到終體積（ 2050 ul），輕輕混勻，在適當(dāng)?shù)臏囟认卤?。?yīng)最后加酶。能否在一次反應(yīng)中用很多的限制性內(nèi)切酶？ 可以，一般而言，甘油濃度超過(guò) 8%對(duì)酶切有抑制。 雙酶切時(shí)要先分析兩種酶且的條件，根據(jù)兩種酶切的緩沖液要求，有三種情況兼 容 性 處 理完全兼容 同時(shí)加 2種酶進(jìn)行酶切完全不兼容 先用一種酶切，沉淀洗鹽，再用另一種酶切相對(duì)兼容 （其中一種酶活性相對(duì)較低）同時(shí)加 2種酶進(jìn)行酶切只是鹽離子濃度不同先用低離子要求的酶切，再補(bǔ)加酶和鹽。酶切產(chǎn)物回收離心柱回收純化酶切產(chǎn)物 DNA片段純化問(wèn)題：純化 PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，推薦柱式，因?yàn)楦钅z手法不準(zhǔn)，很容易割下大塊的膠，影響純化效率。Company: TAKARA Fermentas 連接酶（ ligase)v主要有兩種： T4噬菌體 DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。對(duì)于這種連接反應(yīng)的機(jī)理目前還不清楚，總的來(lái)說(shuō)這種連接的效率比粘性末端的連接效率要低得多，可能是因?yàn)槠侥┒?DNA分子無(wú)法形成類似粘性末端分子那樣的相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。對(duì)于 T4噬菌體 DNA連接酶的活性測(cè)定至少有三種以上的方法：DNA重組 —— 連接DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來(lái)確定。對(duì)于表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，還需識(shí)別其方向。但 37℃ 時(shí)粘性末端分子形成的配對(duì)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個(gè)既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最適溫度即12~16℃ ?？墒狗磻?yīng)速度加快。 一般外源片段較載體摩爾濃度高 ， 5： 1。連接反應(yīng)的一項(xiàng)重要參數(shù)是溫度。多數(shù)情況是變成平末端，這可通過(guò) DNA酶降解，或 DNA聚合酶不平的方式解決。3. (Takara公司 )在 20?l的反應(yīng)體系中， 6?g的 ?DNAHindIII的分解物在 160C反應(yīng) 30分鐘時(shí)，有 90?以上的 DNA片段進(jìn)行連接的酶的活性為 1U。 E. coli DNA 連接酶催化 DNA分子連接的機(jī)理與 T4噬菌體 DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是 ATP而是NAD+。所以， PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。載體多位環(huán)狀 DNA,如果只有一個(gè)酶切位點(diǎn)，用單酶切。限制性內(nèi)切酶提供在 50%的甘油中，故 10 ul反應(yīng)體積中不應(yīng)加入超過(guò) ul的酶。v擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋。應(yīng)查訊分析說(shuō)明。C） 10X反應(yīng)液的體積應(yīng)為終體積的 1/10； 10X反應(yīng)液的體積不應(yīng)小于酶的體積。具體方法如下： 將不加內(nèi)切酶的底物 DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對(duì)照 DNA（有多個(gè)已知酶切位點(diǎn)）同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。少部分酶則須在 70℃ 長(zhǎng)期保存。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（ 65℃ 或 85℃， 20分鐘）。注意：不可振蕩！反應(yīng)溫度 大部分酶的反應(yīng)溫度為 37℃ ；從嗜熱菌中分離出來(lái)的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。使用時(shí)的緩沖液濃度應(yīng)為 1X。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（ 339。如果加入更多的酶，則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間；如果減少酶的用量，對(duì)許多酶來(lái)說(shuō)，相應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（不超過(guò) 16小時(shí)）也可完全反應(yīng)。因此 , 盡量采用規(guī)范的實(shí)驗(yàn)步驟 , 應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。例如 HpaⅡ 和MspⅠ 的識(shí)別順序都是 5’…… CCGG…… 3’，如果其中有 5’甲基胞嘧啶，則只有 HpaⅡ 能夠切割。一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同識(shí)異切酶消化星號(hào)活力限制性核酸內(nèi)切酶作用后產(chǎn)生兩種末端： 鈍性末端 (blunt end) 粘性末端 (sticky end)同尾酶有時(shí)兩種酶切割序列 不完全相同 ，但卻能產(chǎn)生 相同的粘性末端 ，這類酶被稱為 同尾酶 ，可以通過(guò)DNA連接酶將這類末端連接起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。一些酶識(shí)別連續(xù)的序列（如 EcoR I識(shí)別 GAATTC）；而另一些識(shí)別不連續(xù)的序列（如 Bgl I識(shí)別 GCCNNNNNGGC）。實(shí)際
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1